MÉTODOS Y TÉCNICAS DE ESTUDIO MICROBIOLÓGICO
TINCIÓN SIMPLE La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados de las anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrán. Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la molécula está cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno son colorantes básicos. Otros colorantes de esta categoría utilizados con frecuencia en bacteriología son safranina, fucsina básica y verde malaquita. Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los procariotas tienen un pH interno próximo a la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular cargada negativamente, así los colorantes básicos son los más eficaces. Colorantes ácidos con rojo Congo, rosa de bengala, eosina y fucsina ácida tiene un cromóforo cargado negativamente y son utilizados para teñir positivamente ciertos componentes como las proteínas.
Para observar las bacterias teñidas es necesario, en primer lugar, hacer un frotis de las bacterias y fijarlo: Frotis: cuando se parte de un cultivo de bacterias en medio líquido, se toma una o varias cargas directamente con el asa y se extienden sobre el portaobjetos. Si se parte de un cultivo en medio sólido, debe depositarse previamente una gota de agua sobre el portaobjetos. A continuación, se toma con el asa una pequeña parte de la colonia y se dispersa en la gota de agua, realizándose la extensión como en el caso anterior. Fijación: tiene por objeto provocar modificaciones en la composición físico-química de la bacteria (coagulación de las proteínas, etc.) de forma que ésta conserve definitivamente una estructura similar a la que tenía en vivo, sin deformarse como consecuencia de los tratamientos a que se verá sometida durante la tinción. Por otra parte la fijación impide el arrastre de los microorganismos al quedar estos adheridos al portaobjetos y hace que la pared celular sea más permeable a los colorantes. Para la fijación pueden utilizarse agentes químicos (formol, metanol) o el calor. Nosotros emplearemos el calor, y para ello el frotis, una vez seco, se pasa dos o tres veces sobre la llama, con la preparación hacia arriba, para no quemarla.
MATERIAL NECESARIO
Cultivos bacterianos de Staphylococcus aureus y Micrococcus luteus Mechero (Alcohol o Bunsen) Marcador Soporte Colorantes (safranina y cristal violeta) Asa de siembra Aceite de inmersión
MÉTODOS Y TÉCNICAS DE ESTUDIO MICROBIOLÓGICO
PROCEDIMIENTO 1. Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril. 2. Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el asa de siembra. Dejar secar. 3. Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos. 4. Cubrir con una película de colorante (cristal violeta o safranina) durante 1 minuto. 5. Lavar el exceso de colorante con agua. 6. Dejar secar al aire. 7. Añadir una gota de aceite de inmersión. 8. Observar con objetivo de inmersión (100 x).
La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la forma, tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de ser un método muy sencillo y rápido.
Tinción simple con cristal violeta de Staphylococcus aureus. Microscopio óptico de campo claro (100x)
MÉTODOS Y TÉCNICAS DE ESTUDIO MICROBIOLÓGICO
Tinción simple con safranina de Micrococcus luteus. Microscopio óptico de campo claro (100x)
TINCIÓN DIFERENCIAL Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiología; consisten en la aplicación de dos colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso intermedio que provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas células dentro de una población. La diferenciación puede ser provocada por un agente químico o físico, permitiendo observar dos tipos de respuestas diferentes a la tinción en una misma muestra. Las dos tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología son la Tinción De Gram y la Tinción De Ácido-Alcohol Resistencia. TINCIÓN DE GRAM Esta tinción diferencial fue propuesta por el medico danés Christian Gram (1884) (TORTORA et al., 2007) que examinando tejido pulmonar de enfermos fallecidos por neumonía observó que la bacteria Streptococcus pneumoniae, presente en los pulmones, retenía el colorante conocido como marrón Bismark (sustituido posteriormente por el cristal violeta), mientras que el tejido pulmonar no era capaz de retener el colorante. Es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera prueba a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una información esencial, además de sobre la forma, tamaño y agrupación celular, como es el tipo y composición de la pared que presentan las bacterias. La tinción de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo gram positiva y bacterias con pared de tipo gram negativa. La tinción de Gram requiere cuatro soluciones: 1. Primer colorante. Es un colorante básico que en contacto con las células cargadas negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El más utilizado es el cristal violeta. 2. Solución mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Los mordientes empleados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases, como, por ejemplo, una solución diluida de yodo. 3. Agente decolorante. Es un disolvente orgánico, por ejemplo, alcohol-acetona (1:1). 4. Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, como, por ejemplo, la safranina.
MÉTODOS Y TÉCNICAS DE ESTUDIO MICROBIOLÓGICO
MATERIAL NECESARIO Cultivos de bacterias: o Gram positivas: Staphylococcus sp. o Gram negativas: Escherichia coli
Mechero (Alcohol o Bunsen) Marcador Soporte Portaobjetos Asa de siembra
Cristal violeta Safranina Lugol Alcohol-acetona Aceite de inmersión
PROCEDIMIENTO 1. Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril. 2. Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el asa de siembra. Dejar secar. 3. Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos. 4. Cubrir con unas gotas de cristal violeta durante 1 minuto. 5. Lavar el exceso de colorante con agua. 6. Añadir el mordiente lugol, solución de yodo-ioduro potásico, durante 1 minuto. 7. Lavar el exceso de mordiente con agua. 8. Lavar la preparación con alcohol formando un ángulo con la preparación, durante 30 segundos (el tiempo de decoloración es clave para un resultado correcto). 9. Lavar inmediatamente con abundante agua. 10. Cubrir con el colorante de contraste, safranina durante 1 minuto. 11. Lavar el exceso de colorante con agua. 12. Dejar secar al aire. 13. Añadir una gota de aceite de inmersión. 14. Observar con objetivo de inmersión (100 x). La diferente estructura y organización de la pared celular en estos dos tipos de organismos hace que ambos grupos respondan de manera distinta, así mientras las bacterias gram positivas mantienen y conservan el complejo cristal violeta-iodo, las bacterias gram negativas se decoloran rápidamente con la aplicación del alcohol, admitiendo el colorante de contraste que proporciona un color entre rosa y rojo que contrasta con el intenso color violeta.
MÉTODOS Y TÉCNICAS DE ESTUDIO MICROBIOLÓGICO
Tinción de Gram de Bacillus cereus (bacilos gram positivos) Microscopía de cam po clar o (10 0x)
Tinción de Gram de Escherichia coli (bacilos gram negativos) Microscopía de campo claro (100x)
Se han propuesto diferentes explicaciones para justificar la respuesta de los microorganismos a esta tinción, parece que la diferencia se debe tanto a la estructura física como a la composición de la pared celular, en bacterias gram positivas la gruesa capa de péptidoglucano con abundantes entrecruzamientos parece contribuir a la retención del colorante fundamental, cristal violeta, mientras que en bacterias gram negativas la delgada capa de peptidoglucano junto con la abundancia de lípidos en la membrana externa de la pared celular incrementan la porosidad y por ello, contribuyen a la pérdida del colorante fundamental después de la decoloración con alcohol.
MÉTODOS Y TÉCNICAS DE ESTUDIO MICROBIOLÓGICO
MÉTODOS Y TÉCNICAS DE ESTUDIO MICROBIOLÓGICO
MÉTODOS Y TÉCNICAS DE ESTUDIO MICROBIOLÓGICO
Observación microscópica del frotis:
CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6.
7. 8. 9.
Esquematice la estructura de una célula eucariote y procariote. Compare. ¿Qué es un colorante? ¿Cómo está constituido? ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la tinción de Gram? Si se aplica la tinción de Gram de Bacillus sp. con endosporas ¿Cómo se observarían la célula vegetativa y la endospora? ¿Por qué? ¿Existen circunstancias en las que la flora habitual se convierte en patógena? Mencione 5 nombres de microorganismos y su importancia: Gram positivos Gram negativos Capsulados. Esporulados ¿Cuál es la importancia estratégica que tiene el examen directo al momento de procesar una muestra clínica? La tinción de Gram, ¿Qué reacción dará en la levaduras y parásitos? ¿Por qué? Investigue cuales son las estructuras celulares o moleculares responsables de la tinciones. De ejemplos de otros colorantes que se pueden utilizar
