I. Introducción La corr correc ecta ta iden identi tifi fica caci ción ón de un micr microo oorg rgan anis ismo mo perm permit itee ente entend nder er mejo mejorr el comportamiento del mismo, para ello es importante el uso de técnicas especializadas en dicho campo, que que permitan establecer establecer diferencias morfológicas, morfológicas, químicas, físicas entre otras. Ante dicha necesidad, la tinción diferencial de Gram nos brinda la solución, pues permite la diferencia de 2 grupos de bacterias Gram !"# $ Gram !%#, a partir de la estructura de su pared celular. &omo &omo toda toda técnic técnicaa de reconoci reconocimie miento nto tiene cierto cierto pasos pasos que deb debee seguir seguirse se con e'actitud. (mpezando (mpezando por requerir ) soluciones el primero, primero, el colorante b*sico que ti+e la célula el segundo el mordiente, a$uda en la fijación del colorante en las estructuras el tercero, el decolorante que retira el colorante en las Gram !%# mientras que en el otro grupo no tiene efecto dicha sustancia sustancia es principalment principalmentee quien establece establece diferencias diferencias entre ambas di-isiones $ el cuarto que es el contrastante, da el color contrastante al inicial principalmente en las Gram !%#. ('puesto lo anterior se procede a mostrar los procedimientos adecuados así como la fundamentación teóricos para desarrollar dicha técnica.
Objetivos: •
•
emostrar a tra-és de la técnica de tinción diferencial de Gram, la e'istencia de dos grupos principales de bacterias. &omprender el uso de cada compuesto que compone la tinción de Gram $ entender su propósito de uso.
Staphylococcus aureus te+ida por tinción Gram.
II. Materiales y métodos
Materiales
PORTA
SOPORTE PARA TINCIÓN
MECHERO
CRISTAL
TUBO DE ENSAYO CON
ASA DE KOLLE
DECOLORAN
ACEITE DE INMERSIÓN
PINZA
MICROSCOPIO
SAFRANINA
LUGOL
PROCEDIMIENO
1.
Preparar 4 láminas fijas de:
1 Escherichia coli. 2 Staphylococus aureus. 3 Bacillus cereus. 4 Mezcla de los 3 mencionados anteriormente.
Agregar el colorante en exceso: Cristal Violeta. eposar 3! seg"ndos # la$ar la m"estra. 2.
Agregar el mordiente en exceso: %"gol. eposar 2 min"tos # la$ar la m"estra. 3.
4. Agregar el decolorante &'
( gotas: Alco)ol Acetona. *" adici+n sir$e para retirar el colorante de,e repetirse 2 $eces de ser posi,le para "na correcta tinci+n posterior de las -ram '/. %a$ar la m"estra.
5.
Agregar el colorante contrastante en exceso: *afranina 0ejar reposar por 2 min"tos # la$ar .
*ecar la m"estra con papel toalla. 0e,e ser con to"e s"a$es para e$itar la perdida de la m"estra seg"ido limpiar con algod+n la parte anterior del c",re o,jetos para "itar el )"mo segregado por el me)ero. Colocar dos gotas de aceite colocar al microscopio # o,ser$ar. 6.
III. Resultados
/igura 0 1 Escherichia coli !( 1 Gram negati-a
/igura 2 1 Bacillus cereus ! 1 Gram positi-a
/igura 3 1 Staphylococcus aureus !45# 1 Gram positi-a
/igura ) % Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus
!acterias "y combinaciones#
Escherichia coli "EC#.
Bacillus cereus "!C#.
Staphylococcus aureus "'#.
inción $ram
Gram negati-a.
Gram positi-a.
Gram positi-a.
%isuali&ación de la muestra 6eque+as bacterias en forma de cocobacilo !muchas de ellas apenas perceptibles a la -ista#, de color rosado !no llego a te+irse de rojo intenso como se esperaba#. acterias medianas en forma de bacilo, de color -ioleta intenso, mostrando asociación de estreptobacilo. acterias medianas en forma de coco, de color -ioleta intenso, mostrando asociación de estafilococo. 4e obser-a la comparación
del tama+o de las tres bacterias, donde el Bacillus Escherichia coli, Gram negati-a, Gram c. $ el Staphylococcus a. Bacillus cereus, positi-a $ Gram positi-a, muestran tener un tama+o respecti-amente. Staphylococcus idéntico. 7ientras que la aureus. Escherichia c. muestra tener un tama+o mucho menor a tal punto que llega a ser casi imperceptible a la -ista.
I%. Discusión de los resultados 8na de las coloraciones diferenciales m*s aplicadas en microbiología, la tinción Gram, fue in-entada por el médico danés &hristian Gram en 099), cuando buscaba nue-os métodos para colorar bacterias. icha tinción consiste en tratar un :frotis; con un compuesto de la pararosanilina !como por ejemplo, el cristal -ioleta, luego con una solución de ioduro de potasio !lugol#, decolorarlo con alcohol $ finalmente tratarlo con un colorante llamado contraste !que puede ser la fucsina, safranina, marrón ismarc<, etc#. Las bacterias que no pierden el primer colorante luego de ser tratadas con alcohol, apareciendo de color -ioleta, se llaman Gram positi-as. = aquellas que se decoloran con el alcohol $ se decoloran con el segundo colorante o de contraste, apareciendo te+idas de rosado, se denominan Gram negati-as. Así, este método sir-e para distinguir dos grandes grupos de bacterias. "$arassini (.) *+,-#. (n la pr*ctica, se trabajo con tres muestras de bacterias La Escherichia coli , un bacilo Gram negati-o relacionado con las -ías entéricas !patógeno dentro $ fuera de la misma#, es la causa m*s com>n de infecciones de las -ías urinarias $ de sepsis por bacilos Gram negati-os. (s una de las dos causas m*s importantes de meningitis neonatal agente que m*s a menudo acompa+a a la :diarrea del -iajero; también es el anaerobio facultati-o m*s abundante en colon $ heces. (l bacillus cereus, un bacilo Gram positi-o, que al igual que los bacillos Gram positi-os, es un formador de esporas, $ es importante en medicina debido a que causa into'icación alimentaria. = por >ltimo, el Staphylococcus aureus , que al igual que los dem*s estafilococos, son cocos esféricos ordenados a menudo en grupos irregulares, siendo un genero importante en medicina junto con el género Streptococus, $ careciendo de aparato locomotor $ la habilidad de formar esporas. "evinson / 0a1t& E.) *+++#.
La propiedad de retener el colorante es una particularidad característica no solo de bacterias sino también de le-aduras, pero esta propiedad puede -ariar con la edad de la bacteria $ con el p?. el medio principalmente, pues se obser-a que cuanto m*s jo-en es el culti-o m*s fuertemente reaccionan los microorganismos Gram positi-os, perdiendo esta propiedad a medida que el culti-o en-ejece, transform*ndose en Gram negati-os "$arassini (.) *+,-#. 4e -uel-en Gram negati-os debido a que se ti+en por la safranina. An*logo efecto produce en ocasiones por cambios en el medio del organismo, o por ligeras modificaciones en la ejecución de la pr*ctica. 6or este moti-o, es preciso atenerse, en la pr*ctica del procedimiento establecido "Pelc&ar M./ Reid R.) *+22#. 8n ejemplo de mala pra'is en la pr*ctica, es dejar que el decolorante !el alcohol# act>e durante largo tiempo !en -ez de echar unas cuantas gotas a modo de la-ado, como se recomienda en la ma$oría de los manuales, aplicar una gran dosis $@o dejar reposar el decolorante por mucho tiempo# en la muestra. &onsecuencia de ello es que los organismos Gram positi-os pueden decolorarse también, de manera que después de que la tinción se completa, aparecer*n como Gram negati-os. 6or otra parte, si la decoloración no se lle-a a cabo durante tiempo suficiente !respetar el tiempo establecido en la pr*ctica de cada colorante#, los organismos Gram negati-os pueden aparecer como Gram positi-os. 6or lo tanto, se necesita mucha pr*ctica antes de lle-ar a cabo la tinción de gran con é'ito "!urdon 3./ illiams R.) *+4*#. (ste distinto comportamiento de las bacterias se basa en la propiedad que tienen los colorantes b*sicos, deri-ados de la pararosanilina, de formar en presencia de soluciones ioduradas, compuestos iodados, que se fijan intensamente sobre ciertas sustancias, combin*ndose con ellos en forma estable $ que los disol-entes tardan en descolorar "$arassini (.) *+,-#.
(l cuerpo citoplasm*tico de algunas bacterias contienen dichas sustancias, fij*ndose, por lo tanto, el primer colorante fuertemente al actuar la solución de lugol. Los microorganismos, cu$o citoplasma no se combina con los compuestos iodurados del cristal -ioleta, al tratarlos con el alcohol se descoloran $ pierden este colorante, $ al tratarlos con otros colorantes se coloran nue-amente "$arassini (.) *+,-#. enians afirma que el $odo forma con e l-ioleta genciana una gran molécula soluble en el alcohol, que es arrastrada de las bacterias Gram negati-as, $ que retienen las Gram positi-as la diferencia se debería a la distinta permeabilidad de la membrana celular en los dos tipos de bacterias. &hruchman cree que los microorganismos Gram positi-os poseen una zona cortical que es responsable de la retención del colorante. 4tearns $ Atarns han demostrado que las proteínas de las bacterias Gram positi-as tienen un punto isoeléctrico m*s *cido que las de las Gram negati-as, lo que e'plica por qué estos microorganismos muestran ma$or afinidad por los colorantes b*sicos "Merc5ant I./ Pac6er R.) *+47#.
8na hipótesis sugiere que en las bacterias quedan reacción positi-a !que retiene el cristal -ioleta# e'iste un complejo especial de magnesio%*cido ribonucleico%proteína% hidrato de carbono, el cual forma un compuesto insoluble con el colorante $ el iodo.
8na de las obser-aciones que apo$an esta hipótesis es el hecho de que, tratando las bacterias gram%positi-as con la enzima ribonucleasa, se hacen gran%negati-as la ribonucleasa degrada el *cido ribonucleico, $ destru$e así el complejo que se une al colorante. "Pelc&ar M. Reid R.) *+22#. euszen afirma que la tinción de Gram se debe a una reacción química dependiente de la propiedad de la nucleoproteína bacteriana de formar nue-os compuestos. La teoría de &hurchman ha sido reforzada cerca a la década de los setenta por ?enr$ $ 4tace$, quienes han logrado despojar a las bacterias Gram positi-as de una parte escencial de su material Gram positi-o, dejando citoesqueletos $ un e'tracto Gram negati-os. Los in-estigadores mencionados lograron obtener estos resultados realizando un e'tracto de bacterias la-adas a B o& con una solución acuosa de una sal biliar al 2C, en presencia de o'ígeno. (l producto e'traído puede precipitarse por el alcohol $ consiste en ribonucleato de magnesio, polisac*ridos inertes $ -estigios de proteínas. /ue posible de-ol-er la Gram positi-idad a las bacterias :aplicando; el e'tracto al citoesqueleto. Las bacterias fundamentalmente Gram negati-as no responden a esta técnica "Merc5ant I./ Pac6er R.) *+47#.
8na nue-a prueba en apo$o de sus in-estigaciones lo lograron ?enr$ $ 4tace$ cuando consiguieron con-ertir en Gram negati-as algunas especies conocidas por su Gram positi-dad, como Streptococcus salivarius culti-*ndolo en medio totalmente despro-isto de magnesio "Merc5ant I./ Pac6er R.) *+47#. e todas las citas mencionadas, en síntesis, se conclu$e que la e'plicación m*s aceptable de la tinción Gram es que el material Gram positi-o es un complejo macro% molecular, formado por la combinación de un substrato proteico b*sico reducido, con ribonucleato magnésico "Merc5ant I./ Pac6er R.) *+47#. 8na -ez e'plicado el complejo que se forma en las Gram positi-as $ les da el color característico diferencial, se e'plicar* a continuación el porqué dicho material no se escapa de las Gram positi-as pero si de las Gram negati-as una -ez que se usa el decolorante. !urdon 3. y illiams R. "*+4*# nos
sugieren que el car*cter especial de las paredes celulares de los organismos Gram negati-os puede ser el factor determinante. (stas paredes celulares son relati-amente delgadas $ contienen abundante material graso !quiz* diez -eces m*s lípidos que en las paredes de las células Gram positi-as#. 4e ha supuesto que la permeabilidad de las paredes celulares de los organismos Gram positi-os puede disminuirse por efecto de deshidratación al entrar en contacto con el alcohol. (l alcohol puede aumentar la permeabilidad de los Gram negati-os por la e'tracción de los lípidos de la pared celular hecho que permite el escape r*pido del complejo $odo -ioleta de cristal. Pelc&ar M. y Reid R. "*+22# nos
e'plican casi lo mismo Los organismos Gram negati-os tienen un ele-ado contenido graso en sus paredes celulares, ascendiendo hasta el 2BC de dichas paredes. Las pruebas e'perimentales muestran que, durante la pr*ctica
del procedimiento, el tratamiento alcohólico e'trae las grasas, aumentando la porosidad o permeabilidad de la pared celular en los microorganismos Gram negati-os. (l complejo cristal -ioleta%iodo se e'trae así por el alcohol, $ el organismo Gram negati-o se decolora. Las paredes celulares de las bacterias Gram positi-as, a causa de su diferente composición, se deshidratan por el alcohol, el tama+o de los poros disminu$e, se reduce la permeabilidad, $ el complejo cristal -ioleta%iodo no se e'trae. 8na e'plicación m*s actual !siglo 20# pro-iene de Madi8an M./ Martin6o 0./ Dunlan P. y Clarc6 D. "977+#, dichos autores nos e'plican lo siguiente Las diferencias estructurales entre las paredes celulares de bacterias Gram positi-as $ Gram negati-as son las responsables del diferente comportamiento de las células en la tinción Gram. (n dicha tinción, se forma dentro de las células un complejo insoluble cristal -ioleta%$odo que en el caso de las Gran negati-as puede e'traerse con alcohol, pero no en las Gram positi-as. Las bacterias Gram positi-as tienen paredes celulares mu$ gruesas compuestas por -arias capas de peptidoglicano !representando el DBC del material de la pared celular#. Estas se deshidratan por el alcohol, pro-ocando el cierre de los poros de las paredes e impidiendo la salida del complejo cristal -ioleta%$odo. 6or el contrario, en las Gram negati-as el alcohol penetra r*pidamente en la capa e'terna que es rica en lípidos $ la fina capa de peptidoglicano !representando un total del 0BC de la pared celular# no impide el paso del sol-ente u la e'tracción del complejo. espués del tratamiento con alcohol, las bacterias Gram negati-as son casi in-isibles a menos que reciban una tinción de contraste con un segundo colorante en la tinción de Gram. Prescott (./ arley 0. y 3lein D. "9779# nos
e'plican b*sicamente lo mismo que los autores del p*rrafo anterior, sal-o con ciertas anotaciones La retención del colorante, en Gram positi-as, se debe a que el alcohol contrae los poros de la gruesa capa de peptidoglicano. (n consecuencia, el complejo colorante%$odo no es eliminado durante la fase de decoloración u las bacterias continuar*n de color morado. 6or el contrario, la capa de peptidogliano de las bacterias Gram negati-as es mu$ fina, sin tantos enlaces $ con poros de ma$or tama+o, adem*s, también es posible que el tratamiento con alcohol e'traiga suficientes lípidos de la en-oltura de las células Gram negati-as, como para aumentar su porosidad. 6or estos moti-os, el alcohol elimina m*s eficientemente el complejo cristal -ioleta%$odo en las bacterias Gram negati-as. &on estas citas se conclu$e, que la naturaleza física de las paredes de las bacterias Gram positi-as $ Gram negati-as, influ$en bastante en e-itar el escape del complejo cristal -ioleta%$odo que se forma dentro de las bacterias. Adem*s, recalca la e'istencia de dicho complejo que se forma en el interior de las células, $ que les da el color característico de dicha tinción morado o -ioleta.
%. Conclusiones
% La tinción diferencial de Gram efecti-amente muestra la e'istencia de dos grandes grupos de acterias Las Gram positi-as $ las Gram negati-as, ti+éndose de morado $ rojo, respecti-amente. ichas bacterias se diferencian principalmente en la estructura de su pared celular. % icha tinción se fundamenta en la formación de un complejo insoluble cristal -ioleta% $odo en el interior de las células, el cual da el color morado característico de la tinción Gram. icho complejo, una -ez utilizado el decolorante, es retenido en las bacterias Gram positi-as $ en las Gram negati-as no, esto debido a la diferencia de la estructura de sus paredes celulares las Gram positi-as tienen una gruesa capa de peptidoglicano $ las Gram negati-as una delgada capa de peptidoglicano junto con una pared e'terna, adem*s de otras inclusiones en ambos casos. % (s preciso atenerse al procedimiento establecido en la pr*ctica, adem*s de desarrollar la habilidad de manejo. (sto debido a que una mala pra'is puede traer consigo consecuencias no deseadas. Ambas obser-aciones en conjunto, aseguran el é'ito de la pr*ctica a desarrollar.
I%. !iblio8ra;