SPEKTROFOTOMETER UV-Visible Spektrofotometer UV/Vis alat analisis sampel dengan menggunakan prinsip-prinsip absorpsi radiasi gelombang elektromagnetik oleh bahan untuk panjang gelombang sinar UV sampai dengan sinar tampak. Guna UV/Vis spektrofotometer untuk menentukan kandungan zat organik/anorganik dalam larutan. Komponen-komponen spektrofotometer yang penting yaitu: Sumber energi radiasi yang stabil Monokromator (celah, lensa, cermin, dll.) Wadah sampel transparan (cuvet) Detektor radiasi yang dilengkapi recorder.
UV mini-1240 SHIMADZU
Hitachi dual-beam uv-vis spectrophotometer
Skema susunan UV/Vis spektrofotometer Sb. radiasi
Monokromator
sampel
detektor
recorder
Sumber radiasi
Terdiri atas bahan yang dapat tereksitasi ke tingkat energi yang tinggi melalui: a. proses pemanasan dengan bantuan arus listrik b. proses pelepasan elektron pada beda tegangan yang tinggi. Ketika kembali ke tingkat energi yang lebih rendah, bahan akan melepaskan sejumlah foton.
Sumber radiasi Panjang gelombang yang dihasilkan beragam pada daerah pita energi yang luas. Intensitas radiasi yang dihasilkan harus sama dan tetap sehingga tidak ada beda Po pada saat standarisasi dengan Po pada saat pengukuran Penting untuk model single-beam. Pada double-beam, setiap saat Po dan P selalu diukur dan dibandingkan secara simultan sehingga kestabilan sumber radiasi tidak terlalu penting. Sumber radiasi UV:
Lampu hidrogen Lampu deutorium Radiasi yang dihasilkan mempunyai panjang gelombang 180-350 nm.
Tungsten lamp
Lampu xenon menghasilkan radiasi UV dengan intensitas yang lebih tinggi tetapi tidak sestabil lampu hidrogen. Lampu pijar tungsten panjang gelombang pada daerah sinar tampak dan near infrared (panjang gelombang 350-2500 nm) Monokromator Fungsi : untuk memecah radiasi polikromatis dengan pita energi yang lebar yang dihasilkan sumber radiasi menjadi radiasi dengan pita energi yang lebih sempit atau menjadi radiasi monokromatis.
Keuntungan radiasi dengan lebar pita (band width) yang sempit adalah: •Batas daerah yang terabsorpsi sangat berdekatan sehingga kecepatan hasil pengukuran absorbansi menjadi tinggi. •Sensitivitas meningkat karena pengukuran dapat dilakukan tepat pada absorpsi maksimum.
•Kecenderungan mengikuti hukum Beer lebih besar karena yang terukur betul-betul hanya yang dapat terabsorpsi. Monokromator mampu menghasilkan radiasi dengan lebar pita efektif sebesar 35 - 0,1 nm. Lebar pita efektif yaitu kisaran panjang gelombang dimana nilai transmitansi minimal ½ dari nilai maksimalnya.
Komponen –komponen monokromator Celah untuk masuknya radiasi polikromatis dari sumber radiasi. Lensa/cermin untuk menyerap cahaya Pendispersi cahaya yang berupa prisma atau grating yang dapat memecah radiasi menjadi komponenkomponen panjang gelombang. Lensa/cermin pemfokus cahaya
Celah keluar
Monochromator
Wadah sampel (cuvet) Cuvet terbuat dari kuarsa atau silika untuk radiasi UV dan gelas biasa atau kuarsa untuk radiasi sinar tampak. Tebal cuvet bervariasi dari 1-10 cm. Cuvet ditempatkan setelah monokromator supaya kemungkinan terjadinya dekomposisi/fluorescence oleh panjang gelombang berenergi tinggi yang masih ada di dalam radiasi polikromatis dapat diminimalkan. Posisi permukaan cuvet tegak lurus datangnya radiasi sehingga kehilangan radiasi akibat pantulan/ refraksi dapat dikurangi.
Detektor Fungsinya adalah mengabsorpsi foton yang menumbuknya dan mengubahnya menjadi kuantitas yang dapat diukur seperti arus listrik atau perubahan suhu. Sebagian besar detektor modern mengubah energi foton menjadi sinyal listrik yang segera mengaktifkan meteran/recorder.
Syarat detektor: Sensitivitas tinggi sehingga daya radiasi yang kecil dapat terdeteksi. Waktu response yang singkat Stabil. Sinyal elektronik yang dihasilkan mudah diperkuat sehingga dapat dipakai untuk mengoperasikan alat pembaca hasil pengukuran Contoh: Photoelectric detector (Jumlah arus listrik yang dibangkitkan berbanding lurus dengan daya radiasi foton yang terabsorpsi)
Operasi single-beam dan double-beam Single-beam Radiasi dari monokromator yang masuk didispersikan oleh prisma/ grating. Ketika alat pendispersi dirotasikan, berbagai pita radiasi yang telah terpecah difokuskan pada celah keluar. Radiasi dilewatkan sampel dan diterima detektor.
Double-beam Sinar dari monokromator diarahkan ke sel blangko dan sel sampel dengan bantuan beam splitter (chopper). Kedua sinar dibandingkan terus menerus/ bergantian secara berulangulang. Fluktuasi pada intensitas sumber cahaya respon detektor dan hasil penguat sinyal dikompensasi dengan mengamati perbandingan sinyal antara blangko dengan sampel.
Double beam spectrophotometer
Pengukuran konsentrasi Pengukuran konsentrasi zat dalam sampel dengan UV/Vis dapat dilakukan untuk: Single komponen mengandung satu zat terlarut dan pelarutnya. Multi komponen mengandung lebih dari 1 zat terlarut dengan satu pelarut. Sistem single komponen Tahap penentuan konsentrasi meliputi 1. Penentuan max (panjang gelombang yang terserap paling banyak oleh sampel) 2. Penyiapan larutan standar dan sampel 3. Pembuatan kurva standar (kurva kalibrasi) 4. Pengukuran absorbansi sampel.
Penentuan max Zat tertentu
max tertentu
A
Benzen : max = 254 nm
max
Data max untuk beberapa zat tersedia di literatur. Bila tidak ada data max, maka harus dilakukan scanning terhadap sampel yang akan ditentukan konsentrasinya. Kurva standar Untuk mengetahui hubungan konsentrasi dengan absorbansi pada max.
Untuk membuat kurva standard perlu larutan standar (larutan yang konsentrasinya diketahui dengan pasti). Dibuat larutan dengan konsentrasi nol (blangko) sampai konsentrasi tertentu. Pelarut harus dapat melarutkan sampel dengan sempurna dan dapat menghantarkan gelombang dengan daerah panjang gelombang yang dipakai pada analisis. Contoh:
pelarut air (200 nm) pelarut metanol (215 nm)
pelarut etanol 95 % (205 nm) Absorbansi untuk tiap konsentrasi diukur pada max.
Bila larutan memenuhi hukum Beer maka kurva standar akan berupa garis lurus.
A Konsentrasi,ppm
Penyiapan larutan sampel Komponen-komponen yang akan ditentukan konsentrasinya pada daerah UV/Vis sering menunjukkan nilai absorptivitas molar yang tinggi pada absorbansi max. Konsentrasi tinggi
% transmitansi rendah
Keakuratan hasil pengukuran yang terbaik diperoleh pada % transmitansi 36,8 %. Hasil pengukuran dengan tingkat keakuratan yang masih dapat diterima yaitu pada % transmitansi 15 % - 65 %. Pada % transmitansi < 15 % maka ketidakpastian hasil pengukuran sangat tinggi. Oleh karena itu sampel harus diencerkan sampai memberikan % transmitansi pada kisaran yang diinginkan. Pelarut yang dipakai harus sama dengan yang dipakai pada pembuatan kurva standar.
Pengukuran absorbansi larutan sampel dan standar harus dengan cara dan alat yang sama. Berdasarkan absorbansi sampel dibaca pada kurva standar.
larutan
konsentrasi sampel
Contoh analisis kadar amonia dalam sampel dengan UV Vis Cara analisis a. Siapkan 7 buah labu takar 50 mL yang sudah dibersihkan. b. Ambil dengan teliti menggunakan pipet volume larutan standar ammonia 10 mg/L NH3-N dengan volume berturut turut 0 mL, 1 mL, 2 mL, 5 mL, dan 10 mL kemudian masukkan ke dalam labu takar 50 mL. c. Ambil dengan teliti secara duplo (dua kali) menggunakan pipet volume sampel yang akan diuji sebanyak 5 mL dan masukkan ke dalam masingmasing dua buah labu takar 50 mL. d. Tambahkan sedikit aquades menggunakan botol semprot kira-kira 10 mL pada masing-masing labu takar, kemudian homogenkan pelan-pelan. e. Tambahkan larutan zinc sulfate (ZnSO4) sebanyak 0,5 mL menggunakan pipet mikro, lalu homogenkan. f. Tambahkan sedikit aquades menggunakan botol semprot kira-kira 10 mL pada masing-masing labu takar, kemudian homogenkan pelan-pelan.
g. Tambahkan 5 mL reagen nessler B menggunakan pipet volume ke dalam masing-masing larutan standar, blanko, dan sampel. h. Tambahkan sedikit aquades menggunakan botol semprot kira-kira 10 mL pada masing-masing labu takar, kemudian homogenkan pelan-pelan. i. Tambahkan 2 tetes larutan rochelle salt, kemudian homogenkan. j. Tambahkan 1 mL reagen nessler A menggunakan pipet mikro ke dalam masing-masing larutan standar, blanko, dan sampel. Encerkan dengan aquades sampai 50 mL (tanda garis). k. Gojog larutan hingga homogen, dan diamkan ± 30 menit. Gojog lagi agar tetap homogen. l. Ukur nilai absorbansi masing-masing larutan dengan alat spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 430 nm. Lakukan kalibrasi zero dengan larutan blanko yang dibuat. m. Catat hasil pengukuran dalam lembar kerja dan lakukan perhitungan kadar amonia dalam sampel.
Sistem multi komponen Pada sistem multi komponen, lebih dari 1 komponen terlarut yang mengabsorpsi radiasi.
Tiap komponen dianggap tidak saling mempengaruhi absorbansi satu sama lain dan absorbansinya bersifat aditif. Pada absorbansi maksimum komponen I, 1, komponen II juga punya absorbansi dalam jumlah yang berarti. Pada absorbansi maksimum komponen II, 2, komponen I juga menyerap radiasi. Spektrum absorpsi untuk campuran I dan II merupakan jumlah dari masing-masing kurva individual.
I + II A I
I II
1
2
A
1
Panjang gelombang
2
Dengan demikian dapat disusun persamaan berikut:
Pada 1 : AI
1
1
I bc I
1
1
A AI AII Pada 2 : AI
A
2
AI
2
2
1
dan AII
1
I bc I
AII
1
II bc II
1
I bc I II bc II 2
2
1
dan 2
AII
2
2
(1) 2
II bc II
I bc I II bc II
(2)
Dengan:
A1 dan A2
AI 1 dan AI AII
1
1
: Absorbansi campuran yang teramati berturut-turut pada λ1 dan λ2.
2
dan AII
: Absorbansi komponen I dalam campuran pada λ1 dan λ2.
2
2
: absorbansi komponen II dalam campuran pada λ1 dan λ2. 1
I , I , II , II
c I dan c II
2
:Molar absorbtivity komponen I dan II pada λ1 dan λ2.
: konsentrasi komponen I dan II dalam campuran
Absorptivitas molar tiap komponen ditentukan secara terpisah dengan melakukan pengamatan terhadap spektrum absorpsi dari larutan yang telah diketahui konsentrasinya. Jadi nilai cI dan cII dapat dihitung dari persamaan (1) dan (2) berdasarkan data pengukuran A campuran pada λ1 dan λ2.
Secara umum bila ada n komponen dalam campuran, absorbansi total pada panjang gelombang λ memenuhi persamaan:
A An b n cn
n
n
Pada prinsipnya pengukuran n absorbansi pada n panjang gelombang yang berbeda diperlukan untuk menentukan konsentrasi n komponen di dalam campuran maka ada n persamaan simultan dengan n besaran yang tidak diketahui. Bila mungkin, pilih panjang gelombang sehingga hanya 1 komponen yang dapat menyerap panjang gelombang itu. Pilih panjang gelombang yang memberikan nilai absortivitas komponen-komponen dalam campuran yang jauh berbeda satu sama lain.
Masalah yang sering timbul pada pengukuran •Nilai absorbansi terukur negatif
cuvet untuk pengukuran sampel dan blangko berbeda selalu menggunakan cuvet yang sama untuk semua pengukuran.
•Nilai absorbansi terukur > nilai sebenarnya ocuvet untuk pengukuran sampel dan blangko berbeda odinding cuvet tidak bersih (tersentuh jari pemakai)
ocuvet baru saja dipakai mengukur konsentrasi larutan yang lebih pekat. Oleh karena itu maka: •1 cuvet untuk semua pengukuran •dinding cuvet yang dilewati sinar jangan disentuh dengan jari •setiap selesai mengukur absorbansi suatu larutan, cuvet dicuci dengan pelarut yang dipakai untuk membuat sampel sampai benarbenar bersih
•Nilai absorbansi terukur < nilai sebenarnya sama dengan atas. •Titik nol yang tidak stabil -sumber radiasi tidak stabil -adanya noise pada alat penguat sinyal cek titik nol setiap kali pengukuran
PR Analisis nitrat dalam air dilakukan dengan metode Brucine dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Mula-mula dibuat dulu kurva standard dengan cara membuat larutan standard nitrat dengan berbagai konsentrasi yaitu dengan cara mengambil larutan yang mengandung nitrat 10 ppm yaitu berturut-turut 0,5; 1; 2,5; 5, dan 10 mL ditambah dengan aquades, brucine dan asam sulfat pekat dengan volume tertentu. Campuran didiamkan selama waktu tertentu dalam ruang gelap selanjutnya ditambah aquades, dibiarkan lagi selama waktu tertentu dan terakhir diencerkan sampai 50 mL (disebut dengan standard 1, 2, 3, 4 dan 5). Masingmasing larutan standard diukur absorbansinya pada panjang gelombang 410 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Sampel air sejumlah 5 mL diperlakukan sama dengan larutan standard. Pembacaan absorbansi dengan UV-Vis dapat dilihat pada tabel berikut: Absorbansi Blangko Standard Standard Standard Standard Standard Sampel
1 2 3 4 5
0,0 0,01 0,03 0,13 0,28 0,52 0,46
Buatlah kurva standardnya! Berapa konsentrasi nitrat dalam sampel air?
