Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
METODOS DE ANALISIS Práctica 3 Se!aración e identi"icación de a#inoácidos de $ugo de "ruta !or cro#atogra"%a &idi#ensional en ca!a "ina
'ru!o ()*+ Sección , Integrantes •
-ernánde. /a#%re. E#anuel
Pro"esores 'uiller#ina
Cromatografía de Intercambio Iónico La se!aración se &asa !rinci!al#ente en la di"erente a"inidad !ara el interca#&io de iones de los co#!onentes de la #uestra0 Actual#ente1 cuando se lle2a a ca&o so&re colu#nas de !art%culas !eue4as 5 ele2ada e"iciencia1 5 e#!leando 6a&itual#ente detectores conducti#étricos o es!ectroscó!icos1 se deno#ina cro#atogra"%a de iones 7IC80 La cro#atogra"%a de interca#&io iónico se reali.a so&re #atrices ue tienen una carga neta0 La carga de la #atri. de la colu#na as% co#o la carga de las #oléculas de!enderá del !9 del disol2ente 5 de su "uer.a iónica 7!ro!orcional a la concentración de iones80 En unas condiciones deter#inadas serán retenidas en la colu#na las #oléculas o es!ecies ue tengan una carga co#!le#entaria a la de la #atri. del gel 7las #oléculas #oléculas cargadas negati2a#en negati2a#ente te serán retenidas !or una #atri. cargada !ositi2a#ente81 siendo eluidas las restantes0 Para eluir las #oléculas retenidas se !uede 2ariar la carga iónica del disol2ente o su !9 de "or#a ue se alcance el !unto isoeléctrico de la #oléculas o es!ecies de interés o el de la #atri.1 neutrali.ando de este #odo la "uer.a ue retiene a las #oléculas en la colu#na0 Cromatografía Bidimensional Procedi#iento en el ue !arte o todos los co#!onentes de la #uestra se so#eten1 una 2e. se!arados1 a eta!as adicionales de se!aración0 Esto se !uede 6acer1 !or e$e#!lo1 conduciendo a una "racción en !articular ue elu5e de la colu colu#n #na a 6aci 6acia a otra otra colu colu#n #na a 7o sist siste# e#a8 a8 ue ue teng tenga a di"e di"ere rent ntes es cara caract cter er%s %stitica cass de se!aración0 Cuando se co#&ina con eta!as de se!aración adicionales1 se !uede 6a&lar de cro# cro#at atog ogra ra"% "%a a #ult #ultid idi# i#en ensi sion onal al00 En la cro# cro#at atog ogra ra"% "%a a !lan !lana1 a1 cro# cro#at atog ogra ra"% "%a a &idi#ensional se re"iere al !roceso cro#atográ"ico ue 6ace ue los co#!onentes #igren !ri#ero en una dirección 5 luego en otra !er!endicular a ella: las dos eluciones se lle2an a ca&o con elu5entes di"erentes0 APLICACIONES Las técnicas técnicas de a!licación a!licación de la cro#atogra"%a cro#atogra"%a en ca!a "ina se a!lican !ara desarrollar desarrollar las condiciones !ara la se!aración en cro#atogra"%a en l%uidos de alta resolución0 La cro#at cro#atogra ogra"%a "%a en ca!a ca!a "ina "ina tiene tiene a#!lio uso en los la&orato la&oratorio rioss cl%nic cl%nicos os 5 es la estructura de a!o5o de #uc6os estudios &iou%#icos 5 &iológicos0 Ta#&ién Ta#&ién tiene una gran a!licación en los la&oratorios industriales0 Co#o !or e$e#!lo deter#inar ue a#inoácidos están !resentes en alg;n !roducto de ali#entos co#ercial 5 as% sa&er si este !roducto cu#!le con las nor#as #e
OBJETIVOS
los a#inoácidosen !resentes en $ugo de "rutos !or cro#atogra"%a TablaSe!arar 2: Cromatografía capa na bidimensional (cromatograma 3 •
&idi#ensional en ca!a "ina0 •
Identi"icar los a#inoácidos se!arados !or co#!aración de sus 2alores de /" con los de soluciones ti!o de a#inoácidos0
!ES"LTA#OS
Fase móvil 1
Fase móvil 2
Tabla 1: Cromatografía en capa na unidimensional utilizando las dos Aminoácid $% sol¶ to $%separar sol'ente $% sol&to estándar $% sol'ente !f fases móviles los!f aminoácidos o
Lisina
+0(
=0>
?0+@>@
?0>
=0=
?0++@
Arginina
+0(
=0=
?0+>@
?0=
@
?0?@=(
Glicina
30,
=0@
?0+?,
,0+
=0@
?0,>,
30@
=0@
?0@=+
,0,
=0=
?0,@(=
0(
=0@
?0(=>
,03
=0@
?0,>@
Treonina
0@
=0=
?0,33
,0
=0=
?033=
Histidina
(
=0>
?03,>
?0@
=0@
?0+?,(
Tirosina
0>
=0+
?0>?+
0=
=0=
?0+?3
Metionina
0+
=0@
?0=@,?
0,
=0=
?0((
0(
=0=
?0(@
Prolina
Ac. Glutámico
Fenilalanina
03
=0@
?0@?=
Fase móvil 2
Fase móvil 1
Fase móvil 2
(anc)a
$% sol&to
$% sol'ente
!f
$% sol&to
$% sol'ente
!f
Amino*cido
+
+03
=0@
?0+
+
=0
?0+3+(
Lisina
,
3
=0@
?03@
,0
=0
?03+(=
Arginina
-
30(
=0@
?0@=
,0,
=0
?0,@>
'licina
.
0
=0@
?0(+
,0
=0
?03,+
Prolina
/
0=
=0@
?0?,(
+0
=0
?0,+?(
Ac0
Tabla 3: Cromatografía en capa na bidimensional para el desarrollo en las dos fases móviles (cromatograma ! muestra
'lutá#ico 0
0=
=0@
?0?,(
0(
=0
?0(>,+
Treonina
1
(0+
=0@
?0(3@
,0,
=0
?0,@>
9istidina
2
(0(
=0@
?0=?(+
03
=0
?0((=
Tirosina
3
0
=0=
?0@(=+
(0,
=0=
?0=(3
Metionina
+4
=0,
=0=
?0>3(?
=0,
=0
?0>=3
-enilalanina
Fase móvil 1
Fase móvil 2
$% sol&to
$% sol'ente
!f
$% sol&to
$% sol'ente
!f
1
+03
=0=
?0+@@
+
=0=
?0+,>@
2
,0(
=0=
?03,
,0+
=0=
?0,=,=
3
30(
=0=
?0((
,0+
=0=
?0,=,=
4
03
=0=
?0((@
+0@
=0=
?0,33=
5
(0,
=0=
?0=(3
,
=0=
?0,(>=
6
=0=
?0==>,
(0,
=0=
?0=(3
7
=0
=0>
?0>3=
=0?
=0
?0>,+?
Mancha
"anc#a $f 1ra %" $f 2da %" &minoácido 1 0.1688 0.1298 Lisina 2 0.3246 0.2727 Glicina 3 0.4545 0.2727 Prolina bidimensional aminoácidos del *ugo de papa+a !Tabla !: Cromatograma 0.5584 0.2337 Ac. Glutmico 'encontrados, 0.6753 0.2597 !i rosina 0.7792 0.6753 "etionina ) 0.9367 0.9210 Fenilalanina
P!E5"NTAS E6T!AS +0 A#inoácidos ue contenga el $ugo de !a!a 5a utili.ado en la !ráctica
,0 Escri&a la reacción co#!leta 5 con no#&res de la nin6idrina con un a#inoácido /eacción de nin6idrina con glicina !ara "or#ar un co#!le$o a.ul 2ioleta
30 Es !osi&le ca#&iar las "ases #ó2iles
Si es !osi !osi&l &le e #ani #ani!u !ula larr las las "ase "asess #ó2i #ó2ile les1 s1 5a ue ue grac gracia iass a esta estass "ase "asess #ó2i #ó2ile less de!endiendo de la !ro!orción de los co#!onentes de esta "ase !ode#os 6acer ue un a#inoácido corra de una #anera #ás rá!ido o #ás lenta seg;n sea nuestro interés 5 as% !oder tener el control de la se!aración de nuestra #e.cla 0 Indiue las !osi&les "uentes de error de esta técnica Algunos errores ue se !udieron 6a&er co#etido durante la reali.ación de la !ractica "ue ue al #o#ento de a!licar la #uestra !onga#os de #ás 5 esta se $unte con la siguiente a!licación 5 entonces no se se!arara ninguna de las dos de "or#a ó!ti#a o ue la !laca la toue#os con las #anos sin guantes 5 al igual 6a&rá sustancias ue no serán !ro!ia#ente de la #uestra a se!arar0
#ISC"SI7N #E !ES"LTA#OS Co#o se o&ser2a en la ta&la n;#ero uno el a#inoácido ue #ás se des!la.ó a lo largo de la !laca "ue la "enilalanina 5 la #etionina esto de&ido a ue la "ase #ó2il + conten%a cloro" cloro"or# or#o# o#eta etanol nola# a#oni oniaco aco en una !ro!or !ro!orció ción n ,,+ ,,+ !or lo cual cual el cloro" cloro"or# or#o o es 6idro"ó&ico al igual ue la "enilalanina 5 la #etionina lo ue 6i.o ue las interacciones entre estos dos a#inoácidos 5 la "ase #ó2il se lle2ara de una #anera #e$or 5 !or esto "ueron #a5or #ente se!arados de la silica gel #ientras ue los a#inoácidos ue corrieron #enos con esta !ri#era "ase #ó2il "ue la lisina 5 la arginina de&ido a ue co#o estos dos a#inoácidos tienen un gru!o / !olar !ositi2o 5 en nuestra !ri#era #e.cla sola#ente el a#oniaco tiene carga !olar !ero es !ositi2a !or lo ue no interacciono con ninguno de estos de&ido a ue a#&os tienen carga !ositi2a1 sin #encionar ue el a#oniaco es el co#!onente ue se encuentra en #enor !ro!orción0 Al igual en la ta&la !ero a6ora con la segunda "ase #ó2il ue conten%a Butanolcido acéticoAgua en !ro!orciones 3++ el a#inoácido ue #ás se des!la.o "ue la tirosina esto de&ido a ue es un a#inoácido !olar sin carga al igual ue el &utanol 5 el agua !or lo tanto 6u&o #a5or interacción interacción entre la "ase #ó2il 5 este a#inoácido a#inoácido !or lo ue se se!aró #ás #ás a co#! co#!ar arac ació ión n de los los de#á de#áss a#in a#inoá oáci cido dos1 s1 co#o co#o se sa&e sa&e algu alguno noss de los los a#inoácidos ue utili.a#os ta#&ién son !olares sin carga 5 ue no 6a5an corrido igual ue la tirosina !uede ser de&ido a su gru!o / de estos a#inoácidos1 5 los a#inoácidos ue #enos se des!la.aron "ueron la arginina1 6istidina 5 lisina aunue en nuestra "ase #ó2il se encuentra un co#!onente !olar con carga negati2a 7cido acético8 este se encuentra en #u5 &a$a !ro!orción !or lo ue no tu2o su"iciente interacción con nuestros a#inoácidos !olares con carga !ositi2a0 Para el caso de nuestra #uestra los a#inoácidos ue se encontraron si coinciden con los de la &i&liogra"%a aunue no se 6a5aron todos los a#inoácidos ue contiene el $ugo de !a!a5a 5 los /" no "ueron e
CONCL"SIONES
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La cro#at cro#atogr ogra"% a"%a a &idi#e &idi#ensi nsiona onall se utili. utili.a a !ara !ara se!arar se!arar #e.cla #e.cla con #uc6os #uc6os co#!onentes co#o el $ugo de !a!a5a El $ugo de !a!a5a contiene los a#inoácidos lisina1 glicina1 !rolina1 ácido glutá#ico1 tirosina1 #etionina 5 "enilalanina0 La se!aración de los co#!onentes de una #e.cla de!enderá de ue tanta a"inidad tengan !or la "ase #ó2il o !or la "ase estacionaria
BIBLIO5!A$IA 6tt!FFali#entos0org0esFa#inoacidos!a!a5a 7consultado 6tt!FFali#entos0org0esFa#inoacidos!a!a5a 7consultado = de octu&re del ,?+(8 6tt!FFes0slides6are0netFisa&elcorraoFa#ino+ 7consultado 6tt!FFes0slides6are0netFisa&elcorraoFa#ino+ 7consultado = de octu&re del ,?+(8
