UNIVERSIDAD NACIONAL DE UCAYALI FACUALTAD ACUALTAD DE D E CIENCIAS CI ENCIAS FORESTALES ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA FORESTAL
DETE DETERM RMIN INAC ACIÓN IÓN DEL DEL PROT PROTOC OCOL OLO O DE DESI DESINF NFEC ECCI CIÓN ÓN DE SEMI SEMILL LLAS AS DE BOLAINA BLANCA (Guazuma crinita, Mart.) Y CEDRO ( Cedrela odorata , L.) PARA GERMINACION IN VITRO.
Plántulas de cedro y bolaina germinadas en el laboratorio.
Bach. FRANK PETTER APONTE SHUPINGAHUA.
PUCALLPA – PERU. PERU . 2008
DETERMINACIÓN DEL PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN DE SEMILLAS DE BOLAINA BLANCA (Guazuma crinita, MART.) Y CEDRO (Cedrela odorata, L.), PARA GERMINACIÓN IN VITRO. VITRO. DETERMINATION OF THE PROTOCOL OF DISINFECTION OF SEEDS OF BOLAINA BLANCA (Guazuma crinita, MART.) AND CEDAR (Cedrela odorata, L.) FOR IN VITRO GERMINATION. Frank Petter Aponte Shupingahua. Shupingahua. (1)
RESUMEN
Con la finalidad de establecer un procedimiento ideal en la esterilización de semillas de bolaina blanca (Guazuma crinita ) y cedro (Cedrela odorata ), para su germinación In Vitro, se probaron diferentes tiempos de exposición al hipoclorito de sodio al 2%, que consistieron en 10, 30 y 40 min. Los resultados fueron que, para el cedro se requiere 40 min de exposición al desinfectante, desinfectante, obteniéndose 0% de contaminación, contaminación, mientras que en bolaina blanca se requiere 30 min, con iguales resultados. Asimismo se obtuvo que en el porcentaje de germinación se alcanzó 26.66% y 28% para el cedro y bolaina respectivamente. PALABRAS CLAVES: CLAVES: Tiempos de exposición, hipoclorito de sodio, Guazuma crinita Mart, Cedrela odorata L, porcentaje de
contaminación, contaminación, porcentaje de semillas germinadas. ABTRACT.
With the purpose of establishing an ideal procedure in the sterilization of seeds of bolaina blanca (Guazuma crinita) and cedar (Cedrela odorata), for his In vitro germination, they were proved different times of exhibition to the hipoclorito of sodium to 2 %, which consisted of 10, 30 and 40 min. The results were that, For the cedar 40 min of exhibition are needed to the disinfectant, 0 % of pollution being obtained, whereas in bolaina blanca are needed 30min, with equal results. Likewise there was obtained that in the percentage of germination 26.66 % and 28 % were reached for the cedar and bolaina respectively. KEY WORDS: Times of exhibition, hipoclorito of sodium, Guazuma crinita Mart, Cedrela odorata
L, percentage of pollution, percentage of germinated seeds.
(1) Bachiller en Ciencias Forestales - UNU INTRODUCCION
Ante el poco conocimiento conocimiento de las técnicas y procedimientos de propagación in Vitro Vitro para la especi especiee Guazuma hace difí difíci cill dete determ rmin inar ar la Guazuma crinita crinita, Mart, y Cedrela Cedrela odorata odorata, se hace metodología metodología adecuada para introducir de manera aséptica las semillas al cultivo in Vitro, que es el primer paso para propagar micro estacas de plántulas germinadas en condiciones de laboratorio en un medio MS, con el objeto de cultivar grandes cantidades de individuos en espacios reducidos (CALZADA. 1980). Al determinarse el protocolo de desinfección de Guazuma crinita, y Cedrela odorata, se podrá establecer una metodología dentro de un programa de multiplicación In Vitro de la especie en cuestión, además de la posibilidad de multiplicación de explantes de alto valor genético y libre de enfermedades, enfermedades, con lo cual se podrá abastecer a los empresarios dedicados a realizar reforestación, motivo por el cual se convertirá en una actividad rentable para todo aquél que se dedique a la producción de plántulas bajo este método, que a su vez evitará la dependencia de semillas provenientes de los bosques y disminuirá el impacto causado sobre las poblaciones naturales. El presente trabajo tiene como objetivo encontrar el tiempo más adecuado a la exposición exposición de hip hipoc oclor lorito ito de sodio sodio en la esteri esteriliz lizaci ación ón de las las semil semilla lass de BOLAI BOLAINA NA BLANCA BLANCA (Guazuma L.) para para la germ germin inac ació iónn en Guazuma crinita crinita, Mart.) Y CEDRO (Cedrela Cedrela odorata odorata, L.) condiciones de In Vitro. Según FONT QUER (1978), la especie Guazuma crinita Mart., se clasifica dentro del Orden Orden malval malvales es;; Famili Familiaa Ste Stercu rcula lacea ceae: e: Genero Genero Guazum Guazuma. a. Además Además que es un árbol árbol de crecimiento rápido, fuste recto, madera blanda de propagación fácil, abundante semilla, sufre ataque ataque de hormigas. hormigas. Su madera es comercial comercial en la región, región, se utiliza utiliza principalme principalmente nte para viviendas rurales por su bajo costo. Cedrela Cedrela odorata
perteneciente al Orden Sapindales, de la familia Meliaceae. Habita
en tierras altas de la selva y márgenes inundables de los ríos. Es un árbol maderable conocido como cedro y cedro real y se distribuye distribuye desde el norte de México hasta el norte de Argentina. Argentina. Asimismo, es fácil de trabajar, cepillar, tallar, tornear y lijar y posee una alta resistencia al ataque de hongos e insectos (INIFAD. (INIFAD. 1994). Al igual que Swietenia microphylla , el cedro es atacado por el barrenador de brotes, Hypsipyla grandella
Las espec especie iess helió heliófi fitas tas como como la BOLAIN BOLAINA A BLANCA BLANCA ( Guazuma Guazuma crinita crinita, Mart.) Y CEDRO (Cedrela odorata , L.), son bastante requeridos en el mercado de la madera por sus múltiples usos usos (TARIQUE. (TARIQUE. 1987), además VIDAURE (1992), (1992), afirma que bolaina blanca se se adecua bien a suelos del tipo Ultisol, Entisol e Inceptisol, mientras que el Cedro se adapta a una gran variedad de suelos, principalmente principalmente bien drenados, de textura arenosa, franco arenosa y arcillosa (CATIE, 1997). Según DÍAZ, (2000) en 1 kilogramo hay aproximadamente 750,000 semillas de bolaina, el Porcentaje de germinación es de 65 % para semillas frescas en condiciones ambientales con temperatura promedio de 25 °C. Las semillas se pueden almacenar en condi condicio ciones nes ambien ambiental tales es hasta hasta un ti tiemp empoo máxim máximoo de 280 280 días días con un porcen porcentaj tajee de germinación esperada de 40 %. En la propagación por semilla directamente a nivel de investigación se obtuvo 19.75 % de germinación en campo definitivo en suelo mineral con una cobertura de hojas pequeñas secas y 14.75 % en suelo mineral con una cobertura de plantación plantación de arroz. Un kilogramo contiene aproximadamente de 15,000 a 69,000 semillas de cedro, con un promedio de 32,000 y un contenido de humedad de 30%; presenta un porcentaje de pureza de 40 a 70. 70. Bajo Bajo cond condic icio ione ness ambi ambien enta tale les, s, la viab viabil ilid idad ad de las las semi semill llas as dism dismin inuy uyee rápidamente después de un mes, La semilla fresca presenta una viabilidad del 80% y se logra logrann porcen porcenta tajes jes de germi germinac nació iónn de 85 a 95%, 95%, sin tratam tratamien iento to pre germi germinat nativ ivo. o. La germinación se inicia de 8 a 15 días después de la siembra y se completa a los 15 a 18 días (PROSEFOR, 1997). El medio medio de culti cultivo vo es la combi combinac nación ión sólida o líquida de nut nutrie riente ntess y agua. agua. Usualmente incluye sales inorgánicas, inorgánicas , carbohidratos y vitaminas y aminoácidos. aminoácidos . A menudo se denomina Medio Basal y puede ser suplementado con algún regulador de crecimiento y ocasionalmente con otras sustancias varias. El medio de cultivo mas conocido es el MS o de Murashige y Skoog (1962)
En un trabajo de investigación realizado por VILLEGAS (2008), se utilizó una concentración concentración al 2% de hipoclorito de sodio durante 10, 20 y 40 min. para esterilizar semillas de bolaina a ser sembradas en condiciones de In Vitro, donde determinó que no se obtuvieron diferencias entre los tiempos de exposición de las semillas al hipoclorito de sodio, ya que se dio una desinfección del 100% para las tres variables utilizadas. MATERIAL Y METODO. MATERIAL
De Laboratorio Matraces Erlenmeyers Erlenmeyers de 250 y 500 ml Vasos de precipitado de 500 ml Placas petri Pipetas de 1 y 10 ml Probetas de 100 ml Mechero de alcohol Pinzas Tubos de ensayo autoclavable Varillas de vidrio Frascos ámbar Tubo de ensayo Papel aluminio Cintas selladoras Mangos de bisturí Hoja de bisturí Cuchillas
Equipos de Laboratorio Autoclave Estufa Balanza analítica Cámara de flujo laminar Aire acondicionado Refrigeradora Cocina eléctrica Horno Pasteur METODO Se empleó el método experimental, que consistió en cualificar y cuantificar el efecto del tiempo de exposición del hipoclorito de sodio al 2% en la asepsia de las semillas de bolaina y cedro, con lo cual se obtuvo una metodología adecuada para el protocolo de desinfección de esta especie. Preparación del germoplasma. Las semillas utilizadas para el desarrollo del presente trabajo de investigación fueron proporcionadas por el CIDRA (Centro de Investigación y Desarrollo Rural Amazónico), las misma mi smass que fueron fueron extraí extraídas das de árbole árboless selec selecci ciona onados dos con carac caracte terís rístic ticas as fenotí fenotípic picas as superiores, provenientes de plantaciones ubicadas en el bosque Macuya, perteneciente al distr distrito ito de Tournav ournavist ista, a, Provin Provincia cia de Pu Puert ertoo Inca, Inca, Regió Regiónn Huánu Huánuco co.. Las semill semillas as se conservaron en una bolsa de papel dentro de un refrigerador para mantener su viabilidad hasta el día del trabajo en el laboratorio. Las semillas no fueron expuestas a ningún tipo de tratamiento pre germinativo.
Procedimiento de desinfección. El experi experimen mento to se desar desarrol rollo lo en las las insta instalac lacion iones es del del labora laborato torio rio de cultiv cultivos os y vegelates perteneciente a la Facultad de Trópicos y Sub Trópicos de la Universidad de Agricultura de Praga en Republica Checa. Para el procedimiento de desinfección se utilizó en todos los tratamientos, una concentración de alcochol de 96º por 60 segundos, y después se colocó en hipoclorito de sodio al 2%, los tiempos de exposición exposición a dicha concentración concentración se muestran muestran en el siguiente cuadro: Tabla 1.-Tiempo de exposición a una concentración de hipoclorito de sodio al 2%, para el proceso de desinfección de semillas de BOLAINA BLANCA ( Guazuma crinita , Mart.) Y CEDRO (Cedrela odorata , L.), en condiciones de In Vitro. Tratamientos por especie T T1 T2 T3 T4 T5 T6
E cedro cedro cedro bolaina bolaina bolaina
Tiempo de inmersión al hipoclorito de sodio al 2% 20 min. 30 min. 40 min. 20 min. 30 min. 40 min.
Para todos los tratamientos se agregó 2 gotas de Tween 80, como detergente líquido para mejorar la capacidad desinfectante, además cada tratamiento fue expuesto durante dos minutos en alcohol al 96º. Se utilizó un agitador electrónico electrónico para garantizar la homogeneidad en la solución. Al finalizar el tiempo de exposición al desinfectante, se enjuagó las semillas con agua estéril 3 veces, esto se realizó dentro dentro de la cámara de flujo laminar justo antes de la siembra.
Preparación del medio de cultivo. La preparación del medio de cultivo se realizó en base a la constitución de sales de Murashige Skoog (MS), más 4 gr. De Fitagel/litro, también se agrego 30 gr. De sacarosa/litro. Seguidamente el medio de cultivo se distribuyo en frascos de vidrio y cerrados con papel aluminio. Finalmente se introdujo en el autoclave a 121ºC, y 6.8 Kg/cm2, por 15 min., finalmente se dejo enfriar hasta que la solución se gelatinice. Procedimiento Procedimiento de siembra. Se procedió a la siembra de las semillas ya esterilizadas, para esto se utilizo una pinza con la cual se colocaron las semillas en la superficie del medio de cultivo, a razón de una semilla por frasco, haciendo un total de 166 muestras distribuidos en 6 tratamientos. Los frascos se rotularon y colocaron dentro de la cámara de incubación a condiciones controladas de temperatura (25 ºC), y una intensidad lumínica de 4000 luz. Evaluación de parámetros. La evaluación de los índices de contaminación y germinación se realizaron a los 3, 7 y 15 días después de haber sido sembradas las semillas. Tratamiento de datos. Para el ensayo se utilizó un Diseño Completo al Azar (DCR), los porcentajes de los promedios obtenidos en la contaminación y germinación de las semillas en cada tratamiento se sometieron a una prueba de Independencia al 95% grados de libertad.
RESULTADOS. Contaminación de las semillas. Para esta variable se determinó que existe relación entre los tres tiempos de exposición al hipoclorito de sodio y la asepsia de las semillas de cedro y bolaina, como se muestra en los cuadros siguientes: Tabla 2.- Prueba de independencia para el porcentaje de contaminación de cedro. Tratamiento
N° de semillas sembradas
T3 T2 T1
30 40 25
Prueba de independencia independencia (0,05) (% de contaminación) 0 60 100
Tabla 3.- Prueba de independencia para el porcentaje de contaminación de bolaina blanca Trat ratami amiento T5 T6 T4
N° de semi milllas las Prueba de independencia independencia sembradas (0,05) (% de contaminación) 50 0 20 0 25 100
%
100
d
90
e c o n t a m i n a c i
100
100
80 70 60 60 50 40 30 20
o n
10 0
0
0
0 T1
T2
% de contaminacion
T3
T4
T5
T6
Tratamientos
Figura 01. Porcentaje de contaminación de semillas de bolaina y cedro sometidas a diferentes tiempos de exposición a una concentración de 2% de hipoclorito de sodio. En la Figura 01 se observa que T1 y T4 muestran una contaminación de una 100%, mientras que T2 logró disminuir la contaminación contaminación a 60%, pero con los tratamientos T3, T5 y T6, la contaminación se disminuye a 0 %. Germinación de las semillas. Para esta variable se determinó que existe relación entre los tres tiempos de exposición al hipoclorito de sodio y la germinación de las semillas de cedro y bolaina, como se muestra en las tablas siguientes: Tabla 4.-Prueba de independencia para el porcentaje de germinación de semillas de Cedro. TRATAMIENTO T3 T2 T1
N° de semillas sembradas 30 16 25
Prueba de independencia (0,05) % de Germinación 26.66 12.5 0
Resistencia a la germinación 9 - 15 días 9 - 15 días 0
Tabla 5.- Prueba de independencia para el porcentaje de germinación de semillas de bolaina
TRATAMIENTO T5 T6 T4 % d e g e r m i n a c i o n
N° de semillas sembradas 50 20 25
Prueba de independencia (0,05) % de Germinación 28 25 0
30
Resistencia a la germinación 6 - 15 días 6 - 15 días 0
28,00
26,66
25,00
25 20 15
12,50
10 5 0
0,00 T1
% de Germinación
0,00 T2
T3
T4
T5
T6
Tratamientos
Figura 02. Porcentaje de germinación de semillas de bolaina y cedro sometidas a diferentes tiempos de exposición a una concentración de 2% de hipoclorito de sodio. En la Figura 02 se tiene que, tanto T1 como T4 no muestran germinación debido a que estas semillas se eliminaron por presentar contaminación, mientras que T2 muestra 12,5%, de germinación, seguido de T6 con 25%, el tratamiento tratamiento T3 con 26,66% y T5 con 28%.
DISCUSIONES.
En el cuadro 2 se muestra el porcentaje de contaminación en las semillas de cedro, donde se tiene que las semillas de cedro expuestas a 20 min a la concentración de hipoclorito de sodio a 2% (ver Tabla 1) no muestra resultados favorables, ya que se obtuvo un 100% de contaminación de las semillas, siendo el tiempo óptimo para esta especie 40 min, al obtenerse un 0% de contaminación. El porcentaje de contaminación contaminación de semillas de bolaina (Tabla (Tabla 3), se observa que éstas, expuestas a 20 min a la concentración de hipoclorito de sodio a 2% (ver Tabla 1), no tiene efecto positivo para la esterilización de la especie, pero que con 30 y 40 min se tiene que la contaminación disminuye en un 100%. Esto forma un contraste en lo obtenido por VILLEGAS (2008), ya que encontró que no existen diferencias entre los diferentes tiempos de exposición exposición de las semillas de bolaina al hipoclorito de sodio , siendo los resultados de esterilización de las semillas favorables en un 100% a los 10, 20 y 40min., esto deja en evidencia que la procedencia de las semillas y el trato que reciben al momento de ser cosechadas y transportadas juegan un papel importante en la asepsia de las mismas (HARTAMAN. 1995), lo cual se refleja en la complejidad y efectividad para esterilizar el material genético. En la Tabla 4, se tiene el porcentaje de germinación de las semillas de Cedro después del proceso de desinfección, donde las semillas expuestas a 40 min al desinfectante tienen mejores resultados (26.66%), cuya germinación se da entre los 9 y 15 días, esto último coincide con lo obtenido por PROSEFOR (1997), ( 1997), con respecto a la germinación de la especie en el estado natural. En el porcentaje de germinación de las semillas de bolaina blanca se aprecia que las semillas expuestas a 30 min a la concentración de hipoclorito de sodio a 2 % muestran 28% de efectividad, que es el mejor resultado para esta especie, la germinación comenzó desde el día 6 después de la siembra hasta el día 15.
Es interesante mencionar que VILLEGAS (2008) obtuvo porcentajes similares de germinación para la especie de Guazuma crinita Mart, y que, al igual que ahora, la relación
tiempo de exposición al hipoclorito de sodio al 2% (X) - porcentaje de germinación (Y) es parabólica, es decir que a mayor tiempo de exposición menor será la germinación. Al respecto HARTAMAN (1995), señala que la desinfección requiere el empleo de materiales químicos que son tóxicos para los organismos pero relativamente inocuos para le material vegetal. Tanto la efectividad del tratamiento como el daño al tejido viviente aumentan como respuesta al tiempo-dosis, de manera que se debe buscar un equilibrio efectivo de esos factores. CONCLUSION. 1. Los resultados del experimento de esterilizac esterilización ión superficial permitió confirmar que el uso de hipoclorito de sodio fue necesario para obtener semillas libres de contaminantes superficiales. 2. Las semillas de Cedro (Cedrela Cedrela odorata, L.), expuestas por 40 min a una concentración de hipoclorito de sodio al 2 % obtienen 0% de contaminación en el proceso de siembra en condiciones In Vitro. 3. Las sem semill illas as de bol bolai aina na (Guazuma Mart.),, ex expu pues esta tass po porr 30 mi minn a una Guazuma crinita crinita, Mart.) conc concen entr trac ació iónn de hipoc hipoclo lori rito to de sodi sodioo al 2 %
es ópti óptimo mo para para ser ser semb sembra rada dass en
condiciones In Vitro, ya que no se obtuvo contaminación alguna. 4. El tratamiento tratamiento T3 influye influye favorablemente favorablemente en el rompimiento de la dormancia de las semillas de cedro, al obtenerse un 26.66 % de germinación en un periodo de 6 a 15 días después de transcurrida la siembra. 5. Para la especie especie de bolaina blanca, blanca, el tratamient tratamientoo T5 es es le mas mas indicado, indicado, obteniéndose obteniéndose un 28% de germinación en un periodo de tiempo de 6 a 15 días después de transcurrida la siembra.
AGRADECIMIENTOS.
Mi sincero agradecimiento: agradecimiento: A Dios y a mi madre por haberme apoyado en todo momento durante todo el proceso de mis estudios. A La Universidad Nacional De Ucayali, a la Facultad De Ciencias Forestales y al Centro de Invest Investiga igació ciónn y Desarr Desarroll olloo Rural Rural Amazón Amazónic icoo por haber haber hecho hecho posib posible le el conven convenio io de intercambio de estudiantes entre la Universidad Nacional de Ucayali y la Universidad de Agricultura de Praga en República Checa. A la Universidad De Agricultura En Praga por haber brindado sus instalaciones durante el semestre académico “I 2008. “ Al Ing. Pablo P. Villegas por sus enseñanzas en el Laboratorio De Cultivo De Tejidos y Meristemas de la Universidad Nacional de Ucayali.
BIBLIOGRAFIA.
CALZADA, J. 1980. 143 frutales nativos, universidad agraria nacional La Molina. Lima-Perú. 313 p.
CENT CENTRO RO AGRO AGRONO NOMI MICO CO TROP TROPIC ICAL AL DE INVE INVEST STIG IGAC ACIO ION N Y ENSE ENSEÑA ÑANZ NZA A (CATIE). 1,997. Cedro, Cedrela odorata. Costa Rica, Revista Forestal Centroamericana No. 21. 4 p. DIAZ. J. 2000. Posibilidades para el manejo de la regeneración Natural de Bolaina y Capirona en cultivos agrícolas abandonados de la Amazonía Amazonía peruana. En Memoria de VII Congre Congreso so Nacion Nacional al Fores Forestal tal,, Coleg Colegio io de Ingeni Ingeniero eross del del Perú Perú (CIP) (CIP) – Unive Universi rsidad dad Nacional de Ucayali (UNU) Pucallpa – Perú. p. 119 – 120. FONT QUER. 1978. Botánica Pintoresca. Editorial Ramón Sopena. Barcelona España. Pág.717 INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN FORESTAL Y AGROPECUARIAS. INIFAD. 1994. Plantaciones Forestales. Comité Electoral del CENID – COMEF. México. 232p. MURASHIGE, T. and B. SKOOG. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tabaco tissue. P 14. PROCESOR. 1997. CEDRELA ODORAT ODORATA. Proyecto semillas Forestales. Costa Rica Nota Técnica Sobre Manejo de Semillas Forestales Nº 24. pag2. •
TARIQUE. 1987. Variación de las propiedades fisicas y comportamiento al cepillado, moldurado, taladrado y lijado de Guazuma crinita Mart. (bolaina blanca), en Pucallpa. CENFOR XII. Proyecto de capacitación y divulgación forestal. Doc. De trab. Nº 4 Pucallpa 34 p.
•
VIDAURE, H. 1992. Análisis de las características del sitio que prefiere la regeneración natural de Cedrelinga catenaeformis Duke”Tornillo”. Tesis para optar el título de ingeniero forestal. Lima Perú. VILLEGAS P.2008. EFECTO DEL TIEMPO DE EXPOSICION DEL HIPOCLORITO DE SODIO SOBRE LA GERMINACION DE SEMILLAS DE BOLAINA (Guazuma crinita, Mart.). Informe científico. UNU-FCA. Pucallpa-Perú. Pucallpa-Perú. 7 Pág.
