HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) Kromat Kromatogr ografi afi Cair Cair Kinerj Kinerjaa Tinggi Tinggi atau yang yang biasa biasa disebut disebut HPLC HPLC (High Perfomance Liquid Chromatography) merupakan Chromatography) merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan dan pemu pemurn rnia ian n seny senya aaa tert tertent entu u dala dalam m suat suatu u samp sampel el!! KCKT KCKT meru merupak pakan an meto metode de dala dalam m kromatografi yang didasarkan pada penggunaan kolom berlubang kecil dengan diameter antara " mm # $ mm dan isi kolom berupa partikel kecil dengan (%&m ' $&m) yang memungkinkan keseimbangan secara cepat antara fase gerak dan fase diam! Teknologi ini memerlukan sistem pompa tekanan tinggi yang mampu mengalirkan fase gerak dengan tekanan yang sangat tinggi mencapai % atmosfer agar tercapai laju aliran beberapa ml per menitnya! KCKT ini dapat menghasilkan pemisahan yang sangat cepat dengan keunggulan *at'*at yang tidak tahan panas ataupun tidak menguap dapat dikromatografi tanpa peruraian atau tanpa perlu membuat deri+ate yang menguap! menguap! KCKT ini digunakan digunakan baik baik untuk analisis analisis kualit kualitatif atif dan kuantit kuantitatif atif (,nonim (,nonim -..$)! Keterbatasan KCKT adalah untuk identifikasi senyaa kecuali jika dihubungkan dengan spectromet spectrometer er massa! massa! /an keterbatasa keterbatasan n lainnya lainnya adalah sulit mendapatkan resolusi yang baik apabi apabila la samp sampel el yang yang diuj diujii terl terlal alu u kompl komplek eks! s! Kegun Kegunaa aan n umum umum dari dari KCKT KCKT adala adalah h untu untuk k memisahkan sejumlah senyaa organik anorganik maupun senyaa biologis! /apat juga untuk analisis ketidakmurnian (impurities) (impurities) analisis senyaa yang tidak mudah menguap (non'+olatil) menentukan menentukan molekul'molekul molekul'molekul netral netral ionic maupun zwitter ion ion pemisahan senyaa dengan struktur yang hampir sama juga pemisahan sekumpulan senyaa dalam jumlah yang banyak (0andjar ".)! P12342P HPLC Prinsi Prinsip p dasar dasar HPLC HPLC (High (High Perfor Performan mance ce Liquid Liquid Chromat Chromatogr ografi afi)) adalah adalah pemisa pemisahan han senyaa'senyaa berdasarkan kepolaran perbedaan afinitas dan keofisien partisi antara fase mobile mobile (gerak (gerak)) dan fase fase stasio stasioner ner (diam) (diam)!! 5ase 5ase mobile mobilenya nya adalah adalah sampel sampel dan eluen eluen yang bercampur dan fase stasionernya adalah silika gel yang mengandung hidrokarbon! 4ehingga
1
senyaa yang memiliki kepolaran yang lebih tinggi akan tertahan pada fase stasioner yang bersifat polar! 67324 HPLC Hampir semua jenis campuran solute dapat dipisahkan dengan KCKT karena banyaknya fase diam yang tersedia dan selektifitas yang dapat ditingkatkan dengan mengatur fase gerak! 8erdasarkan polaritas relati+e fase gerak dan fase diamnya maka dikelompokkan menjadi KCKT fase normal dan fase terbalik di mana pada fase normal polaritas fase diam lebih tinggi daripada fase gerak! 4edangkan pada fase terbalik fase geraknya lebih polar jika dibandingkan fase diam! 8erdasarkan pada fase diam dan atau berdasarkan mekanisme sorpsi solute memberikan suatu jenis KCKT yang lebih spesifik! KCKT berdasarkan hal ini diuraikan menjadi yaitu kromatografi adsorbsi adsorbsi kromatogra kromatografi fi partisi partisi kromatograf kromatografii penukar ion dan kromatografi kromatografi eksklusi ukuran (0andjar ".)! -! krom kromat atogr ograf afii ads adsor orbs bsii Penyerapan pada permukaan saja yang melibatkan interksi'interaksi elektrostatik seperti ikatan hydrogen penarikan dipol'dipol dan penarikan yang diinduksi oleh dipol! 4olut akan bersaing dengan fase gerak untuk u ntuk berikatan dengan sisi fase diam! 8iasanya menggunakan silica sebagai sebagai fase diamny diamnya! a! Terdap erdapat at gugus gugus hidrok hidroksi si yang yang pada pada silica silica dan alumina alumina yang yang akan benrinteraksi dengan solut! ,danya gugus silanol dengan reaktifitas yang berbeda'beda menyebabkan solute dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor! Perlu Perlu adanya adanya penamba penambahan han pelaru pelarutt yang yang polar polar sepert sepertii air untuk untuk mening meningkat katkan kan kemamp kemampuan uan elusiny elusinyaa untuk untuk menghi menghindar ndarii tailing ! 4olut' 4olut'sol solut ut akan tertah tertahan an karena karena adanya adanya adsops adsopsii pada pada permukaan gugus aktif silanol dan akan terelusi sesuai dengan urutan polaritasnya (0andjar ".)! "! Krom Kromat atog ogra rafi fi parti partisi si Partisi merupakan proses sorpsi yang analog dengan ekstraksi pelarut! Kromatografi ini sering disebut dengan kromatografi fase terikat dimana fase diam cair diikatkan pada padatan lapis tipis lemban (inert)! /alam partisi yang sebenarnya solute akan terdistribusi di antara fase gerak dan fase diam sesuai dengan kelarutan relatif di antara keduanya! Pada umumnya fase 2
diam yang digunakan adalah silica yang dimodifikasi secara kimiai seperti hidrokarbon' hidrokarbon non'polar seperti oktasilsilan oktasilana atau dengan fenil! /an yang digunakan sebagai fase gerak adalah campuran methanol atau asetonitril dengan air atau larutan buffer (0andjar ".)! Pada kromatografi partisi ini digunakan fase diam dan fase gerak dengan polaritas yang berbeda! 6ika fase gerak polar dan fase diam non'polar dikenal sebagai kromatografi terbalik maka senyaa non'polar yang larut dalam hidrokarbon dengan 89 : - seperti +itamin larut lemak dan antrakinon dapat dipisahkan berdasarkan afinitas terhadap fase diam (,nonim -..$)! Terdapat interaksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang meleati kolom! 2nteraksi yang terjadi tidak akan sekuat interaksi antara rantai'rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul'molekul polar dalam larutan! Pada senyaa non polar dalam campuran akan cenderung berikatan dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya +an der ;aals! 4enyaa'senyaa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen! 2ni berarti baha molekul'molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom (Clark "<)!
6ika fase gerak bersifat non'polar dan fase diam polar maka *at yang bersifat polar seperti golongan amina dan alkohol dapat dikromatografi (fase normal)! Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut no n polar misalnya heksan! 4ebuah kolom sederhana memiliki diameter internal =!> mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang -$ sampai "$ mm! 4enyaa polar yang meleati kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyaa'senyaa non polar sehingga senyaa yang non polar kemudian akan lebih cepat meleati kolom! 5ase gerak yang non'polar dapat dimodifikasi dengan penggunaan pelarut yang lebih polar sehingga
dapat mengurangi retensi dan mengubah
pemisahan (,nonim -..$)!
3
%! kromatografi penukar ion /igunakan terutama untuk pemisahan *at'*at yang larut dalam air yang ionic atau yang dapat terionisasi dengan bobot molekul kurang dari -$! 5ase diam yang umum digunakan adalah resin organik sintetik dengan gugus aktif yang berbeda'beda dimana pada resin terdapat gugus aktif yang bermuatan negati+e dan digunakan untuk memisahkan *at'*at bersifat basa (resin penukar kation) dan gugus aktif bermuatan positif untuk menarik *at'*at dengan gugus fosfat sulfonat atau karboksilat (resin penukar anion)! 4enyaa larut air yang ionik atau yang terionisasi akan mengalami tarikan oleh resin dan perbedaan dalam afinitas akan menyebabkan terjadi pemisahan (,nonim -..$)! =! Kromatografi eksklusi ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyaa dengan berat molekul ? " dalton! 5ase diam yang digunakan dapat berupa silica atau polimer yang bersifat porus sehingga solute dapat meleati porus (leat di antara partikel) atau berdifusi leat fase diam! 9olekul solute yang memiliki 89 jauh lebih besar akan terelusi terlebih dahulu kemudian molekul'molekul yang berukuran medium dan terakhir adalah adalah molekul yang jauh lebih kecil! Hal ini dikarenakan molekul yang bisa tidak dapat meleati porus akan tetapi leat di antara partikel fase diam! Pada pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solute dan fase diam seperti kromatografi yang lain (0andjar ".)! 234T1@973T,42 2nstumentasi pada KCKT terdiri dari komponen'komponen penting yaitu A adah fase gerak sistem penghantaran fase gerak alat untuk memasukkan sampel kolom detector adah penampung buangan fase gerak tabung penghubu ng integratorB perekam (0andjar ".)!
Pumping unit 4
Pompa dipilih untuk memenuhi tujuan analisis!,nalisis pertama kali dilakukan dengan menggunakan pemisahan isokratik dimana komposisi eluen tetap tidak berubah selama analisis! Teknik ini adalah cukup untuk perpisahan sederhana! Ketika sampel berisi banyak komponen seperti contoh untuk analisis asam amino dianalisis sangat sulit untuk memisahkan semua komponen secara efektif dengan menggunakan hanya satu eluen! 4ebuah analisis gradien memungkinkan komposisi eluen yang akan berubah selama analisis! Hal ini sering menunjukkan baha gradien konsentrasi yang akan dihasilkan secara linear! 3amun jika komposisi eluen berubah secara bertahap ini disebut gradien langkah (,nonim "--)! Pemisahan unit Kolom dipilih sesuai baik sampel dan tujuan pemisahan! +en kolom digunakan untuk mempertahankan suhu kolom konstan! 6ika suhu kolom dii*inkan untuk ber+ariasi selama analisa kualitatif atau kuantitatif aktu elusi komponen akan berubah sehingga analisis yang akurat tidak dapat dilakukan! 4uhu analisis ℃ antara "$ dan $ sering dipilih (,nonim "--)! /eteksi unit Komponen dielusi dari kolom terdeteksi dan data deteksi dikon+ersi menjadi sinyal listrik! /etektor dipilih sesuai sampel (,nonim " --)! Pengolahan unit data Konsentrasi dari setiap komponen yang terdeteksi dihitung dari daerah atau tinggi dari puncak yang sesuai dan dilaporkan! 9eskipun sebelumnya mudah digunakan terutama digunakan integrator sistem di mana PC melakukan baik operasi unit dan analisis hasil baru' baru ini memainkan peran sentral (,nonim "--)! Cara Kerja A analit diinjeksikan dengan " cara yaitu injeksi ke dalam arus yang mengalir dan injeksi aktu Daliran berhentiE! Teknik ini dilakukan dengan alat suntik syringe atau katup suntik! 8eberapa sistem katup memiliki sebuah tabung lingkar yang diisi dengan *at uji kemudian dipindahkan oleh sistem katup ke arus fase gerak yang mengalir! 1ongga yang telah terisi tersebut kemudian oleh sistem katup dialihkan ke dalam arus bertekanan tinggi! Pada teknik Daliran berhentiE aliran kolom dihentikan dan setelah tekanan pada tempat penyuntikan
5
turun hingga nol tempat penyuntikan dibuka dan analit disuntikkan! Kemudian tempat penyuntikan ditutup dan pompa dijalankan kembali (,nonim -..$)! /ari kolom sampel dijadikan fase bergerak dengan adanya fase gerak dan berinteraksi dengan fase diam berdasarkan afinitas elektron! 4etelah terpisah dengan berbagai perhitungan matematis HPLC yang sudah disambungkan dengan komputer ini memberikan pembacaan berupa kromatogram peak! Kemudian dibuang melalui saluran pembuangan (Clark "<)!
KCKT memiliki " jenis detektor yaitu detektor uni+ersal (yang mampu mendeteksi *at secara umum tidak bersifat spesifik dan tidak bersifat selektif) seperti spektrometri massa dan golongan detektor yang spesifik seperti detektor @F'Fis detektor fluorosensi elektrokimia (0andjar ".)!
8eberapa jenis detektor dalam HPLCyaitu A 6
(Chserhati-...)
Pada umumnya menggunakan detektor yang spesifik seperti detektor @F'Fis! leh karena itu diperlukan suatu reaksi deri+atisasi di mana produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultra+iolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyaa berfluoresens sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri! /eri+atisasi dapat dilakukan baik sebelum masuk ke kolom ( pre column derivatization) atau setelah kolom ( post column derivatization).
7
Pada deri+atisasi sebelum kolom analit dideri+atisasi lebih dahulu sebelum diinjeksikan ke dalam kromatografi sementara itu pada deri+atisasi setelah kolom analit diinjeksikan dulu ke kolom lalu dideri+atisasi setelah keluar kolom tetapi sebelum mencapai detektor! /eri+atisasi ini lebih ditujukan untuk deteksi analit (0andjar ".)! HPLC ini digunakan untuk asam organik seperti asam formiat dan asam asetat dll! 6ika sampel mula'mula berbentuk padatan harus didistruksi dulu sehingga didapat larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi (Clark "<)! Tujuan utama penggunaan deri+atisasi pada HPLC adalah untuk A -! 9eningkatkan deteksi "! 9erubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik %! 9erubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik =! 9enstabilkan analit yang sensitif (Clark"<)
3,T12@9 ,L73/13,T 3atrium alendronat
adalah
golongan
bifosfonat yang
dapat
berikatan dengan
hydroGyapatite pada tulang dan bertindak sebagai inhibitor pada proses resorption tulang untuk peraatan osteitis deformans postmenopausal dan osteoporosis! 3atrium alendronat berbentuk bubuk kristal larut dalam air agak larut dalam alkohol dan tidak larut dalam kloroform aseton dan asam asetat! 4ecara kimia natrium alendronat sering disebut (='amino'-'hydroGybutylidene) bisphosphonic acid monosodium salt trihydrate dan biasanya ia berbentuk sediaan oral! 4truktur umum dari natrium alendronat A
8
4isi rantai bertanggung jaab terhadap chemical'physiclal properties mekanisme resorption
dan
pharmacokinetiknya!
Hal
ini
menunjukkan
baha
kekuatan
ikatan
biphosphonates dengan kristal hydroGyapatite pada lokasi pergantian tulang akan meningkatkan akti+itasnya dan menghambat pembentukan agregasi dan disolusi kristal (,nonim "--)! /,342L KL12/, /ansil klorida ini memiliki eG %%< nmI em =." nm pada kloroform (setelah deri+atisasi dengan heGylamine) dan memiliki titk lebur
72-74 °C!
4ecara kimia dansil klorida sering
disebut $'(/imethylamino)naphthalene'-'sulfonyl chloride! ,plikasi dari senyaa ini adalah biasa digunakan untuk reagen fluorogenik untuk deri+atisasi 3'terminal dari asam amino dan peptida yang dideteksi dengan HPLC fase terbalik (Janetta -.<)! 8erikut ini strukturnya A
(Janetta -.<)!
9
KROMATOGRAFI PARTISI Prinsip pemisahan adalah partisi *at terlarut (sampel) di antara fase gerak dan fase diam! /alam kromatografi partisi cair'cair suatu pemisahan dipengaruhi oleh distribusi sampel antara fase cair diam dan fase cair bergerak dengan membatasi kemampuan pencampuran! 6ikasuatu*atterlarutdikocokdalamsistem
"
pelarut
yang
tidakbercampur
(melarutkan)
maka*atterlarutakanterdistribusi di antara kedua fase dan jika kesetimbangan tercapai maka koefisien partisinya (K d) A
K d =
konsentrasi zat terlarut pada pelarut A konsentrasi zat terlarut pada pelarut B
Pemisahan didasarkan pada pemanfaatan perbedaan koefisien partisi dari komponen' komponen campuran terhadap fase bergerak (cair) dan fase diam yang juga berupa *at cair sebagai lapisan film pada support! 4ebagai support dapat digunakan absorben pada kromatografi penyerapan! Pasangan pelarut tidak boleh tercampur B larut dan keduanya harus dalam keadaan DequilibriumE yaitu dengan mengocoknya dalam corong pisah lalu dibiarkan memisah! 8agian yang lebih polar digunakan sebagai fase diam yaitu sebagai lapisan film pada support!4ebagai support biasanya digunakan silica gel atau serbuk selulosa dan sebagai fase diam biasanya digunakan air! 8ila sebaliknya yaitu pelarut nonpolar digunakan sebagai fase diam (miasalnya ben*en) dan pelarut polar sebagai fase bergerak maka tekhnik ini disebut ‘reversephase chromatograpy! !Kecepatan proses pemisahan dapat dinyatakan dengan harga 1f dari komponen yang bersangkutan
R f =
jarak yang ditempuh zat terlarut jarak yangditempuh pelarut
9akin besar harga 1 f maka sampel makin cepat merambat dari tempat semula! Hubungan antara harga 1 f dengan koefisien partisi K d dapat dinyatakan dengan rumus berikutA
10
R f =
Am Am+ Kd As
,m luas rata'rata diameter fase bergerak ,s luas rata'rata diameter fase diam 6ika molekul suatu *at terlarut dalam keadaan terus'menerus bergerak dari fase diam ke fase bergerak dan sebaliknya beberapa molekul karena tidak sama energinya akan tinggal lebih lama dari pada yang lainnya dalam fase bergerak ataupun ada yang tinggal lebih sebentar! 2ni akan menghasilkan suatu pita yang merupakan kur+a konsentrasi karakteristik mirip dengan kur+a distribusi! Koefisien partisi selalu berubah terhadap temperatur sehingga nilai 1 f akan ber+ariasi juga! Hal ini disebabkan kandungan air pada fase organiknya! @ntuk menghindari pengaruh perubahan temperatur maka pemisahan dilakukan dengan ruang kromatogarfi yang tersekat ataupun pada termostat! 4elama pergerakannya kecepatan pelarutakan berubah karena +iskositasnya makin mengecil! Pada saat pelarut merambat sepanjang kertas (kertas saring) yang digunakan dalam kromatografi kertas kertas akan menghilangkan air pelarut (kertas saring dapat mengabsorbsi sampai dengan " air)! /alam atmosfer yang tidak jenuh menghilangkan air akibat air yang terkondensasi akan menyebabkan komposisi pelarut menjadi tidak seragam! leh karena itu atmosfer harus dipelihara B dijaga agar tetap jenuh dengan pelarut!6ika digunakan pelarut yang tidak mudah menguap maka akan terjadi fenomena yang dikenal sebagai /emiGion yaitu terbentuknya dua garis permukaan (front) cairan pada kertas! Kelebihan'kelebihan Kromatografi Partisi ' 1eprodusible dam pemisahan dapat diramalkan dari data kelarutan! - Koefisien partisi konstan pada daerah (range) konsentrasi yang lebih lebar!
11
-
Puncak simetris dan tajam sehingga dengan pasangan pelarut yang cocok merupakan metode pilihan!
12
Aplikasi 3atrium aldronat digunakan sebagai
pengobat osteoporosis! /ibutuhkan deri+atisasi
karena natrium aldronat tidak memiliki gugus kromofor pada strukturnya! 9etode analisis natrium alendronat yang telah dilakukan dan dipublikasikan menggunakan LC'94! 9etode analisis yang paling sering digunakan adalah dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) detektor fluoresensi karena memiliki tingkat kepekaan yang tinggi daya pisahnya baik dan aktu analisis yang cepat! Terdapat " macam detektor pada KCKT yaitu detektor elektrokimia natrium alendronat dideri+atisasi dengan menggunakan pereaksi "% naftalen dikarboksialdehid (3/,) dan 3'asetil'/'penisilamin (3,P) sedangkan untuk detektor fluoresensi pada saat ini hanya digunakan pereaksi .'fluorenilmetil kloroformat (59C)! Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan suatu metode analisis dengan menggunakan pereaksi dansil klorida sebagai penderi+at hal ini didasarkan pada sifat kimia dari dansil klorida yang dapat bereaksi dengan gugus amin primer pada natrium alendronat membentuk suatu senyaa yang berfluoresensi!
Cara kerja ,! Penentuan panjang gelombang larutan dansil klorida Larutan dansil klorida yang siap pakai diukur intensitasnya dengan menggunakan spektrofluorometer! 8! Pembentukan senyaa deri+atisasi 1) Penentuan pH dapar natriu kar!"nat ter#adap pe!entukan sen$a%a deri&at /imasukkan dalam tabung sentrifugasi -$ mL larutan standar natrium alendronat sebanyak -$ ML (konsentrasi - MgBmL) /itambah - ML dapar natrium karbonat -9 (pH .I ."I .$I .
13
/isuntikkan sebanyak $ ML pada kolom C-N dengan fase gerak asetonitrilmetanol'dapar ("$ m9 KH"P= dan "$ m9 asam sitrat) ("A-$A>$ +B+) dengan kecepatan alir -!mLBmenit 2ntensitas deri+at diukur pada panjang gelombang terpilih ') Penentuan jula# dansil kl"rida ter#adap pe!entukan sen$a%a deri&at /imasukkan dalam tabung lalu ditambah - ML larutan standar natrium alendronat sebanyak -$ ML dengan konsentrasi - MgBmL /itambah dapar natrium karbonat - 9 (pH yang terpilih pada percobaan -) dan -I "
14
Tutup rapat tabung dengan aluminium foil campur dengan menggunakan termomi"er -= rpm dengan temperatur yang terpilih pada percobaan % selama = $ < dan . menit kemudian disentrifugasi -! rpm selama "$ menit /isuntikkan sebanyak $ ML pada kolom KCKT *) Penentuan kesta!ilan sen$a%a deri&at ++ $an, ter!entuk /imasukkan dalam tabung larutan standar natrium alendronat sebanyak -$ ML dengan
konsentrasi - MgBmL /itambah - ML dapar natrium karbonat -9 (pH yang terpilih pada percobaan -) /itambah larutan dansil klorida yang terpilih pada percobaan " (reaksi dilakukan di dalam ruangan gelap) Tutup rapat tabung dengan aluminium foil campur dengan menggunakan termomi"er -= rpm dengan temperatur yang terpilih pada percobaan % selama aktu yang terpilih pada percobaan = kemudian disentrifugasi -! rpm selama "$ menit /isuntikkan sebanyak $!ML pada kolom KCKT 2ntensitas deri+at yang terbentuk diukur pada inter+al aktu % > dan . menit
C! Penentuan komposisi fase gerak Larutan standar natrium alendronat sebanyak -$ ML dengan konsentrasi - MgBmL dimasukkan kedalam tabung sentrifugasi -$ mL kemudian dideri+atisasi dengan dansil klorida sesuai dengan kondisi yang sudah optimum lalu disuntikkan sebanyak $ ML pada kolom C-N dengan komposisi fase gerak sebagai berikut A -) ,setonitril'metanol'dapar ("$ m9 KH"P= dan "$ m9 asam sitrat) ("A-$A>$ +B+) ") ,setonitril'metanol'dapar ("$ m9 KH"P= dan "$ m9 asam sitrat) ("$A-$A> +B+) %) ,setonitril'metanol'dapar ($ m9 KH"P= dan "$ m9 asam sitrat) ("A-$A>$ +B+) =) ,setonitril'metanol'dapar ($ m9 KH"P=) ("A-$A>$ +B+) $) ,setonitril'metanol'dapar (- m9 KH"P=) ("A-$A>$ +B+) >) ,setonitril'dapar ("$ m9 KH"P= dan "$ m9 asam sitrat) (=A> +B+) <) ,setonitril'dapar ("$ m9 KH"P= dan "$ m9 asam sitrat) (%$A>$ +B+) N) ,setonitril'dapar ("$ m9 KH"P= dan "$ m9 asam sitrat) (%A< +B+) Kecepatan alir yang digunakan yaitu - mLBmenit! Kemudian catat aktu retensi jumlah lempeng teoritis H7TP dan faktor ikutan /! Penentuan kecepatan aliran fase gerak terhadap aktu retensi senyaa deri+atisasi Larutan standar natrium alendronat sebanyak -$ ML dengan konsentrasi - MgBmL dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi -$ mL lalu dideri+atisasi dengan dansil klorida 15
sesuai dengan kondisi yang sudah optimum lalu disuntikkan sebanyak $ ML pada kolom C-N dan alirkan dengan fase gerak terpilih dengan +ariasi kecepatan ( NI -I -" dan -$ mLBmenit) kemudian catat aktu retensi jumlah plat teoritis hitung H7TP dan faktor ikutan! 7! Pengujian linieritas Larutan natrium alendronat diencerkan dengan fase gerak terpilih dengan rentang konsentrasi "I =I $I >I dan - MgBmL kemudian dideri+atisasi sesuai dengan kondisi yang sudah optimum selanjutnya disuntikkan sebanyak $ ML ke alat KCKT dengan fase gerak dan kecepatan aliran terpilih! 8uat kur+a persamaan regresi linier melalui perbandingan luas puncak terhadap konsentrasi natrium alendronat dalam larutan dari masing'masing konsentrasi! /ihitung nilai r (koefisien korelasi) dari *at tersebut! 5! Pengujian limit deteksi dan limit kuantitatif 8atas deteksi dan kuantitasi dihitung secara statistikal garis regresi linier dari kur+a kalibrasi! 3ilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada garis linier y a O bG sedangkan simpangan baku balangko sama dengan simpangan baku residual 4yBG!
16
HASIL A. P/M0AHASA. /alam analisis natrium aledronat ini detektor yang digunakan adalah detektor fluoresensi sehingga penderi+at yang digunakan merupakan pereaksi fluorogenik! /etektor pada HPLC dikelompokkan menjadi " golongan yaituA detektor uni+ersal (yang mampu mendeteksi *at secara umum tidak bersifat spesifik dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti detektor @F'Fis detektor fluoresensi dan elektrokimia! 2dealnya suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut A -! 9empunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel! "! 9empunyai sensitifitas yang tinggi yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil! %! 4tabil dalam pengopersiannya! =! 9empunyai sel +olume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita! $! 4ignal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier)! >! Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak! /etektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor @F'Fis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu! /i samping itu juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyaa yang mamapu berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri! Karena natrium alendronat tidak memiliki gugus kromofor maka dalam analisisnya memerlukan suatu langkah deri+atisasi! /eri+atisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisika'kimia suatu analit!
17
4uatu reaksi deri+atisasi harus mempunyai syarat'syarat sebagai berikut yakniA produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultra+iolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyaa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometriI proses deri+atisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (- )I produk hasil deri+atisasi harus stabil selama proses deri+atisasi dan deteksiI serta sisa pereaksi untuk deri+atisasi
harus
tidak
menganggu
pemisahan
kromatografi!
8erbagai macam agen penderi+at telah tersedia antara lain A
(Chserhati-...) Pemilihan panjang gelombang analisis sangat penting untuk meningkatkan sensiti+itas dan selekti+itas! 8erdasarkan spektrum serapan yang diperoleh panjang gelombang %" nm dipilih sebagai panjang gelombang eksitasi dan =.$ nm dipilih sebagai panjang gelombang emisi!
18
1eaksi deri+atisasi natrium alendronat
,! Penentuan pH dapar natrium karbonat terhadap pembentukan senyaa deri+at
1eaksi deri+atisasi biasanya berlangsung pada pH basa senyaa deri+at dapat terbentuk dalam range pH .'--! ptimasi pH dapar natrium karbonat ini sangat penting agar senyaa deri+at yang terbentuk nantinya bukan hasil samping dari reaksi tetapi senyaa deri+at yang memang diinginkan! 8erdasarkan hasil pengamatan pH yang optimum untuk pembentukan senyaa deri+at dari natrium alendronat adalah pH -! 8ila pH terlalu tinggi akan menghasilkan senyaa yang yang lain karena yang akan terbentuk bukanlah senyaa deri+at yang diinginkan melainkan senyaa sulfonat! Kur+a hubungan antara pH dapar karbonat dengan area senyaa deri+at yang terbentuk dapat dilihat pada 0ambar "!
19
8! Penentuan jumlah dansil klorida terhadap pembentukan senyaa deri+at Pada saat mereaksikan suatu pereaksi penderi+at dengan senyaa yang tidak memiliki kromofor sebaiknya pereaksi penderi+at yang digunakan berlebih! /ata pengamatan optimasi jumlah dansil klorida ini teernyata menghasilkan reaksi pembentukan senyaa deri+at yang optimum apabila jumlah dari dansil klorida yang ditambahkan N kali dari jumlah natrium alendronat! /ari hasil pengamatan dengan jumlah dansil klorida "< ML (N kali jumlah natrium alendronat) telah dapat membentuk suatu senyaa deri+at yang sempurna alaupun masih dapat dilihat adanya serapan dari kelebihan larutan dansil klorida! Kur+a hubungan antara jumlah dansil klorida yang ditambahkan dengan area senyaa deri+at yang terbentuk dapat dilihat pada 0ambar %!
20
C! Penentuan temperatur terhadap pembentukan senyaa deri+ate
Pada suhu $ oC merupakan temperatur optimum untuk pembentukan senyaa deri+at! 8ila suhu terlalu tinggi maka senyaa deri+at yang terbentuk akan terhidrolisis kembali sehingga area senyaa deri+at yang dihasilkan lebih kecil begitu juga jika suhu terlalu rendah maka senyaa deri+at belum terbentuk sepenuhnya sehingga area senyaa deri+at tidak optimum!
21
/! Penentuan aktu terhadap pembentukan senyaa deri+at
Pada aktu inkubasi $ menit di hasilkan senyaa deri+at yang optimum jika semakin lama aktu inkubasi senyaa deri+at yang terbentuk akan terhidrolisis kembali sehingga kurang optimum begitu juga jika aktu inkubasi di baah $ menit senyaa deri+at tersebut juga belum optimum! 7! Penentuan kestabilan senyaa deri+atisasi yang terbentuk
4enyaa deri+at pada menit ke % > dan . stabil karena aktu retensi dan area yang diperoleh tidak mengalami perubahan yang terlalu signifikan! Pada menit ke % ditetapkan sebagai kondisi
optimal karena perubahan area dari senyaa deri+at yang terbentuk tidak
mengalami perubahan yang terlalu signifikan!
22
Pada optimasi pembentukan senyaa deri+at dari natrium alendronat reaksi dilakukan di ruangan gelap untuk mencegah terurainya senyaa deri+at yang terbentuk dan memerlukan termomi"er karena pembentukan senyaa deri+at harus dengan pengocokan yang konstan! Penentuan kondisi instrument kromatografi ptimasi komposisi fase gerak untuk analisis natrium alendronat menggunakan metode HPLC ini telah dilakukan dan didapatkan komposisi fase gerak yang optimum adalah asetonitril' metanol'dapar ("$ m9 KH"P= dan "$ m9 asam sitrat) ("A-$A>$I +B+)! ,lasannya adalah dengan komposisi fase gerak ini dihasilkan jumlah pelat teoritis yang besar dengan nilai H7TP dan faktor ikutan yang kecil! ptimasi kecepatan alir pada instrumen untuk analisis natrium alendronat ini juga telah dilakukan! 4esuai hasil pengamatan maka didapatkan kondisi kecepatan gerak optimum yang digunakan adalah - mL B menit karena menunjukkan aktu retensi nilai H7TP dan faktor ikutan yang cukup baik! @ji linieritas Linieritas merupakan suatu metode pengukuran untuk melihat hubungan antara respon dan berbagai +ariasi konsentrasi! Hasil linieritas yang baik apabila terbentuk suatu kur+a kalibrasi yang menghasilkan garis yang liniear dan lurus! @ntuk uji linearitas digunakan seri larutan baku natrium alendronat dimana seri larutan baku yang digunakan berjumlah $ buah dengan rentang konsentrasi " ' -!Mg B mL! Hasil persamaan regresi yang diperoleh menunjukkan baha larutan natrium alendronat menghasilkan koefisien korelasi (r) sebesar ...$! Hal ini berarti baha pembentukan senyaa deri+at antara natrium alendronat dengan dansil klorida memenuhi uji linieritas! @ji limit deteksi dan kuantitasi @ji L/ dan L penting untuk dilakukan! ,lasannya adalah untuk mengetahui batas terendah dari konsentrasi suatu *at yang masih dapat ditentukan dengan metode yang digunakan secara akurat dan presisi! /alam hal ini metodenya adalah HPLC! 4emakin kecil nilai limit deteksi dan limit kuantitasi maka metode yang digunakan semakin sensitif! 23
Perhitungan limit deteksi dan kuantitasi natrium alendronat dilakukan dengan menggunakan perhitungan secara statistik melalui regresi linier dari kur+a kalibrasi! Limit deteksi yang diperoleh dan teramati untuk larutan natrium alendronat pada konsentrasi %= MgBmL dan limit kuantitasi yang diperoleh dan teramati pada konsentrasi --= MgBmL!
24
K/SIMPLA. -! Kondisi optimal deri+atisasi natrium alendronat dengan reagen dansil klorida pada
pH
- I +olume dansil klorida "< MLI dilakukan penggojogan memakai temomi"er pada temperatur $!C selama $ menit dan aktu (kestabilan senyaa deri+at) pada menit ke %! "! Kondisi optimal instrumentasi A fase gerak asetonitril'metanol'dapar ("$ m9 KH"P= dan "$ m9 asam sitrat) ("A-$A >$I +B+) dan kecepatan alir - mL B menit! %! /etektor yang digunakan adalah detektor fluoresensi dengan panjang gelombang eksitasi %" nm dan panjang gelombang emisi =.$ nm! =! ;aktu retensi natrium alendronat -.<$N menit!
25
AFTAR PSTAKA
,nonim -..$ #arma$ope %ndonesia& 7disi 2F -.'--- /epkes 12 6akarta ,nonim "-- HPLC'mino cid nalyzer 2 httpABB!hitachi'hightech!com diakses tanggal N 9ei "-,nonim"-- httpABBchemicalland"-!comBlifescienceBpharB,L73/13,T7"4/2@9!htm diakses tanggal -N 9ei "-Clark
6!
"<
High
Performance
Liquid
Chromatography
HPLC
httpABB!chemguide!co!ukBanalysisBchromatographyBhplc!html diakses pada tanggal . 9ei "-Cserhati T! ,nd 5orgacs 7! -... Chromatography in #ood science and *echnology Technomic Publishing Lancaster 8asel 0andjar 2!0! dan ,bdul 1ohman ". +imia #armasi nalisis %".'%%- % Pustaka Pelajar Qogyakarta 0rritter1!6!-..- Pengantar +romatografi edisi 22 hal ->'-N= 2T8 8andung 1ohman ,! ". +romatografi ,ntu$ nalisis -at 0raha 2lmu Qogyakarta Janetta 6!P! et al!-.< *he utilisation of dansyl chloride for quantitative determination of free amino acids and partial analysis of primary structure of proteins $- ==-'=$N 6! Chromatogr 3e Qork
26
