LAPORAN PRAKTIKUM KI3261 METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK PERCOBAAN 07 ISOLASI DAN AMPLIFIKASI DNA DENGAN TEKNIK PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Nama
: Aviv Sigit Cahyono
NIM
: 10513035
Kelompok
: Kelompok I
Tanggal Percobaan
: 12 April 2017
Tanggal Pengumpulan : 19 April 2017 Asisten
: Yessy
LABORATORIUM BIOKIMIA PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2017
Isolasi dan Amplifikasi DNA Dengan Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) Aviv Sigit Cahyono NIM : 10513035 Kelompok : 01 Asisten : Yessy
[email protected] Abstrak (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama adalah DNA cetakan, Oligonukleotida primer, Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), Enzim DNA Polimerase, dan Komponen pendukung lain adalah senyawa buffer. Pada proses PCR menggunakan menggunakan alat termosiklus. Sebuah mesin yang memiliki kemampuan untuk memanaskan sekaligus mendinginkan tabung reaksi dan mengatur temperatur untuk tiap tahapan reaksi. Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengn cepat yaitu denaturasi, anneling, dan pemanjangan untai DNA. Produk PCR dapat diidentifikasi melalui ukurannya dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Teknik PCR dapat dimodifikasi ke dalam beberapa jenis diantaranya : PCR- RFLP, PCR – RAPD, nested- PCR,Quantitative – PCR, RT- PCR dan inverse – PCR. Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi. Hal ini didasarkan atas spesifitas, efisiensi dan keakuratannya. Kata kunci: PCR, In vitro, Elektroforesis, Teknik PCR
Abstract (Polymerase Chain Reaction, PCR) is an enzymatic method for the amplification of DNA by means of in vitro. In the PCR process takes several main components is DNA template, oligonucleotide primers, Deoksiribonukelotida triphosphate (dNTP), DNA polymerase enzymes, and other supporting components are buffer compounds. In using the PCR process using termosiklus tool. A machine that has the ability to heat the reaction tube at once cool and regulate the temperature for each stage of the reaction. There are three important stages in the process of PCR which always recur in cycles and lasts 30-40 with less rapid namely denaturation, anneling, and elongation of DNA strands. PCR products can be identified by its size using agarose gel electrophoresis. The PCR technique can be modified into several types including: PCR- RFLP, PCR - RAPD, PCR nested-, Quantitative- PCR, RT-PCR and inverse - PCR. The advantages of PCR said to be very high. It is based on the specificity, efficiency and accuracy. Keywords: PCR, In vitro, Electrophoresis, PCR technique 1. PENDAHULUAN Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik in vitro yang dapat mengamplifikasi bagian DNA tertentu yang berada di anatra dua bagian urutan DNA dan ditemukan oleh Kary Mullis pada 1985. Penemuan ini mengantarkan Kary Mullis menerima hadiah nobel kimia pada 1993 (Newton, 1997). 16S rDNA adalah suatu gen yang mengkode 16 rRNA, yaitu: suatu komponen 30S dari ribosom. Isolasi gen 16S rDNA dilakukan dengan mengamplifikasi urutan nukleotida gen dengan teknik PCR. Amplifikasi DNA dengan PCR dapat dilakukan menggunakan primer oligonukleotida atau disebut juga amplimer. Primer ini adalah suatu molekul DNA untai tunggal pendek yang berkomplemen dengan ujung urutan DNA templat. Primer akan diperpanjang pada DNA templat oleh
DNA polymerase dengan keberadaan deoksinukleosida trifosfat (dNTPs). Proses ini akan menghasilkan rantai DNA baru yang berkomplemen dengan rantai templat sehingga menghasilkan rantai DNA untai ganda baru. Sintesis rantai DNA dapat diulang melalui proses denaturasi termal molekul DNA untai ganda, penempelan primer pada DNA dan perpanjangan primer oleh DNA polimerase pada temperatur yang sesuai dengan kerja enzim. Pada prokaryota terdapat tiga jenis RNA ribosomal, yaitu 5S, 16S, dan 23S rRNA. Di antara ketiganya, 16S rRNA yang paling sering digunakan. Molekul 5S rRNA memiliki urutan basa terlalu pendek, sehingga tidak ideal dari segi analisis statistika, sementara molekul 23S rRNA memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup panjang sehingga menyulitkan analisis. Analisis gen penyandi 16S rRNA telah menjadi
prosedur baku untuk menentukan hubungan filogenetik dan menganalisis suatu ekosistem. 16S rRNA dapat digunakan sebagai penanda molekuler karena molekul ini bersifat ubikuitus dengan fungsi yang identik pada seluruh organisme. Molekul ini juga dapat berubah sesuai jarak evolusinya, sehingga dapat digunakan sebagai kronometer evolusi yang baik. Dua molekul 16S rRNA memiliki beberapa daerah yang memiliki urutan basa yang relatif konservatif dan beberapa daerah urutan basanya variatif. Perbandingan urutan basa yang konservatif berguna untuk mengkonstruksi pohon filogenetik universal karena mengalami perubahan relatif lambat dan mencerminkan kronologi evolusi bumi. Sebaliknya, urutan basa yang bersifat variatif dapat digunakan untuk melacak keragaman dan menempatkan galur-galur dalam satu spesies. Saat ini dikembangkan metode identifikasi berbasis molekuler yang lebih cepat dengan tingkat sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi, yaitu dengan analisis sekuensing gen 16S rRNA (16S ribosomal Ribonucleic acid/Asam ribonukleat pengkode ribosom 16S, S menyatakan Svedberg, yaitu satuan ukuran ribosom). Gen 16S rRNA juga sering disebut sebagai 16S rDNA (16S ribosomal deoxyribose nucleatic acid), namun menurut konsensus dari American Society for Microbiology (ASM), istilah 16S rRNA dinilai lebih tepat. Tujuan percobaan ini adalah mengisolasi dan memperbanyak fragmen gen 16S rDNA dari koloni tunggal dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) dan menentukan massa molekul fragmen gen 16S rDNA dengan metode elektroforesis gel agarosa.
dalam tabung 3 sebagai kontrol positif. Lalu, dimasukkan semua tabung ke dalam mesin PCR. C. Elektroforesis Agarosa Elektroforesis agarosa dilakukan untuk menganalisis ukuran fragmen DNA. Gel agarosa dibuat dengan melarutkan 0,75% agarosa ke dalam buffer TAE 1x (Tris-asetat 0,04 M; Na2EDTA 0,001 M pH 8) dengan cara pemanasan. Digunakan larutan hingga suhu -50°C. kemudian ditambahkan EtBr sebanyak 0,5 μL. Larutan ditunangkan ke dalam cetakan gel dan dibiarkan hingga membeku. Setelah beku, gel diletakkan ke dalam alat elektroforsis (Bio-Rad) kemudian diisi dengan buffer TAE 1x hingga tanda batas. Sampel yang akan di elektroforesis disiapkan dengan mencampurkan larutan sampel dan larutan pemberat (bromfenol biru 0,1 (b/v) dan sukrosa 40% (b/v)) dengan poerbandingan volum 5:1. Pencampuran dilakukan di atas lembar parafilm. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 80 V selama 35 menit. 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Pengamatan
2. METODE PERCOBAAN A. Lisis sel bakteri Sebanyak 40 μL ddH2O steril dipipet ke dalam tabung mikro 1,5 mL. Bakteri diinokulasi dari cawan petri menggunakan tusuk gigi steril ke dalam tabung yang telah berisi air trsebut. Lalu didihkan campuran sampel selama 10 menit menggunakan penangas air. Didiamkan sampel sampai suhunya sama dengan hingga suhu ruang. Dilakukan sentrifuga sampel dengan kecepatan 12.000 x g selama 1 menit. Diambil supernatannya dan dipisahkan ke alam tabung mikro yang steril. B. Amplifikasi DNA dengan PCR Supernatan yang telah diperoleh digunakan sebagai DNA templat. Dipipet campuran reaksi 4x didalam tabung mikro 200 μL kemudian disiapkan 3 tabung mikro 200 μL, aliquot 24,55 μL ke dalam masing-masing tabung dari campuran reagen yang tlah dibuat. Dimasukkan 0,5 μL DNA tempalt ke dalam tabung 1 (sampel), ddH2O dalam tabung 2 sebagai kontrol negatif, dan DNA kromosom ke
Pembahasan Pada percobaan ini, dilakukan isolasi dan memperbanyak fragmen gen 16S rDNA dari koloni tunggal dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). 16S rDNA adalah subunit ribosom yang dapat digunakan sebagai pembeda, penanda dan sebagai tanda evolusi pada bakteri. Molekul ini dapat berubah sesuai dengan waktu evolusinya sehingga dapat digunakan sebagai kronometer evolusi yang baik. Molekul 16S rDNA memiliki susunan basa yang relatif konservatif dan juga variatif. Urutan basa yang variatif ini dapat digunakan untuk mengetahui keragaman galurgalur dalam satu spesies. Gen 16s rDNA yang diisolasi berasal dari E. coli yang memiliki jumlah
pasang basa sekitar 1500. E. coli merupakan salah satu bakteri yang termasuk bakteri gram negatif. Gram negatif adalah bakteri yang akan berwarna merah atau merah muda ketika proses pewarnaan gram, sedangkan gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna violet ketika proses pewarnaan gram (Madigan, 2006). Gen 16S rRNA adalah gen yang bersifat lestari (conserved) dan dijumpai pada setiap organisme. Struktur yang lestari ini menyebabkan gen 16S rRNA dapat digunakan dalam PCR dan analisis sekuensing. Dalam struktur gen ini terdapat sejumlah basa yang disebut hypervariable region untuk merupakan ciri khas yang membedakan tiap organisme. Gen pengkode rRNA adalah gen yang mampu mempertahankan kelestariannya selama jutaan tahun keanekaragaman evolusi. Sebagian besar prokariot memiliki 3 jenis rRNA, yaitu 5S, 16S dan 23S. Penggunaan 5S rRNA juga sudah dipelajari namun gen ini terlalu kecil untuk digunakan dalam penentuan filogenetik. Gen 16S dan 23S rRNA memiliki ukuran yang cukup untuk dianalisis. Gen 16S rRNA berukuran sekitar 1550 pasang basa dan sekitar 500 basa di bagian ujung sekuens merupakan daerah yang disebut dengan hypervariable region. Daerah inimerupakan bagian yang membedakan antar organisme. Primer yang digunakan dalam amplifikasi sekuens akan mengenali daerah yang lestari dan mengamplifikasi hypervariable region, dengan demikian akan diperoleh sekuens yang khas pada organisme tersebut. PCR adalah teknik amplifikasi DNA secarain vitro yang dikembangkan oleh Karry Mullis. Dengan menggunakan teknik ini dapat pula dilakukan amplifikasi segmen DNA dalam jutajutaan kali hanya dalam beberapa jam (Handoyo, 2000). Daerah yang diperbanyak dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Pada teknik ini dibutuhkan DNAuntai ganda yang berfungsi sebagai cetakan yang mengandung DNA target untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polierase, deoksinukleosida trifosfat (dNTPs) dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase akan mengkatalisis pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan DNA templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan
fosfat pada 5’ DNTP yang ditambahkan. Oleh karena itu, proses penambahan DNTP berlangsung dengan arah 5’ ke 3’. Dalam prosesnya PCR melibatkan beberapa teknik yaitu yaitu predenaturasi DNA templat, denaturasi DNA templat, penempelan primer, pemanjangan primer, pemantapan (post extension). Tahap kedua hingga keempat merupakan tahapan berulang (siklus). Denaturasi atau pemisahan ikatan untai ganda DNA dilakukan dengan menaikkan suhu pada 95-98oC sehingga dihasilkan dua untai tunggal DNA. Apabila dalam DNA target mengandung banyak nukleotida G atau C, suhu denaturasi dapat ditingkatkan. Dua untai DNA yang dihasilkan ini akan digunakan sebagai templat. Penempelan primer terjadi pada kondisi suhu yang diturunkan menjadi 37-50oC tergantung dari DNA yang digunakan. Penurunan suhu ini berfungsi untuk mengikatkan primer dengan untai tunggal DNA templat yang berkomplemen dengan primer tersebut. Perpanjangan primer dengan memanfaatkan DNA polimerase, enzim ini dapat mensintesis komplemen dari untai tunggal DNA dari ujung 3’ yang didahului dengan proses penempelan primer. Pada tahap ini suhu dinaikkan hingga 72oC. Akhir dari siklus pertama ini adalah dihasilkan dua untai ganda DNA. Pada percobaan ini tahapan reaksi PCR digunakan suhu 95 oC sebagai suhu predenaturasi untuk menyakinkan bahwa molekul DNA target yang ingin dilipat gandakan jumlahnya benar-benar terdenaturasi. Kemudian 48oC untuk anneling dan 72oC untuk pemanjangan rantai primer. Sedangkan suhu 95 oC yang kedua adalah suhu untuk memisahkan untai ganda DNA pada siklus-siklus selanjutnya dan 72 oC yang kedua adalah untuk mengecek kembali urutan basa DNA ketika polimerisasi berjalan. Jumlah kopi fragmen DNA (amplikon) yang dihasilkan dengan menggunakan teknik PCR ini dapat ditentukan dengan perumusan: Y = ( 2n– 2n), dimana XX = jumlah molekul DNA templat awal; n = jumlah siklus; Y = jumlah amplikon. Siklus PCR yang terjadi sebagai berikut: 1). Denaturasi, 2). Annealing dan 3). Elongasi, 4). Siklus pertama selesai
Dalam melakukan percobaan dengan teknik PCR ini digunakan beberapa reagen yaitu DNA templat, primer maju (primer forward), primer mundur (primer reverse), ddH2O, dream Taq polymerase, dNTP dan Buffer dream Taq polymerase. DNA templat sebagai cetakan dalam pembentukan molekul DNA baru, DNA templat ini dapat diperoleh dengan menggunakan metode lisis sel adalah perusakan dinding sel namun tanpa merusak DNA yang menjadi target. Dalam percobaan yang dilakukan lisis sel dilakukan dengan penambahan air, pemanasan dan pengadukan secara makanik. Namun tidak hanya itu, metode lisis juga dapat dilakukan dengan menggunakan buffer lisis, komposisi yang digunakan tergantung pada jenis sampel. Contoh buffer lisis adalah buffer K yang memiliki komposisi buffer PCR (50mM KCl, 10-20mM TrisCl dan 2,5mM MgCl2); 0,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL Proteinase-K. Cara lain adalah isolasi DNA kromosom atau plasmid adalah dengan memecah dinding sel kemudian DNA kromosom atau plasmid dipisahkan dari komponen lain sehingga memiliki kemurnian yang tinggi. Primer yang digunakan dalam percobaan kali ini adalah primer maju (primer forward), primer mundur (primer reverse). Primer mundur memiliki urutan 5'-GGTTAC(G/C)TTGTTACGACTT-3' dan primer maju memiliki urutan 5'AGAGTTTGATC(A/C) TGGCTCAG-3' (Nurachman, 2010). Primer ini akan menempel padaujung untai tunggal DNA templat. Setelah itu primer akan mengalami polimerisasi dari tempat penempelannya pada 3’ ke 5’ DNA templat. Sehingga pada akhirnya akan diperoleh dua pasang untai ganda DNA apabila DNA templat sebelumnya berupa sepasang untai DNA. Untuk proses penempelan primer perlu ada perancangan terlebih
dahulu, apabil urutan DNA yang dituju belum diketahui maka dapat dilakukan analisis homologi dari urutan DNAyang memiliki kekerabatan terdekat. Perancangan primer harus memenuhi beberapa kriteria yaitu panjang primer, komposisi primer, titik leleh. Primer yang digunakan biasanya berkisar 18-30 basa. Apabila digunakan primer yang pendek maka kemungkinan terjadinya mispriming (penempelan primer pada tempat yang salah) akan tinggi yang akan mempengaruhi efisiensi proses PCR, sedangkan bila digunakan primer panjang (lebih dari 30 basa) tidak akan meningkatkan spesifisitas primer. Dalam percobaan ini digunakan ddH2O (aqua bidestilasi atau ultra pure water) namun sebenarnya juga dapat menggunakan buffer TAE yang merupakan campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA pada konsentrasi tertentu. Keduanya dapat dilakukan untuk melarutkan DNA atau RNA. DNA akan lebih stabil apabila dilarutkan dalam TAE buffer karena dijaga pada pH 8. Jika menggunakan ddH2O akan menimbulkan perubahan pH karena DNA memiliki sifat asam lemah dan dapat menyebbakan degradasi DNA. Namun, dalam kasus penggunaan PCR ddH2O lebih unggul karena tidak mengandung chelating agent, sedangkan TAE buffer mengandung EDTA yang dapat berkompleks dengan ion Mg2+ sehingga mengganggu kerja enzim Taq polymerase. Pada enzim polimerase DNA yang digunakan dalam percobaan ini adalah dream Taq polymerase yang diisolasi dari bekteri Thermus aquaticus. Enzim ini berfungsi sebagai katalis untuk reaksi polimerisasi DNA. Enzim yang digunakan untuk PCR berasal dari bakteri termofilik dan hiper termofilik sehingga bersifat termostabil sampai temperature 95oC. Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) terdiri dari dATP, dTTP, dCTP dan dGTP yang bertindak sebagai building block DNA dan diperlukan dalam proses perpanjangan. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer dan memebentuk untai baru yang berkomplemen dengan untai DNA templat (Handoyo, 2000). Buffer dream Taq polymerase berfungsi untuk menjaga pH medium karena reaksidalam PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Pada percobaan ini juga ditambahkan MgCl2 karena untuk menstimulasi aktivitas DNA polimerase membutuhkan Mg 2+ sebagai kofaktor yang berikatan dengan sisi aktif dari enzim yaitu gugus karboksilat pada residu aspartat. Interaksi primer dengan templat akan
meningkat dan membentuk kompleks yang larut dengan dNTP. Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan kemampuan atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini digunakan untuk memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul. Prinsip gel elektroforesis agarosa adalah suatu elektroforesis DNA dimana teknik untuk memisahkan sampel dna berdasarkan berat molekul ddan struktur fisik molekulnya. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif. Digunakan gel agaraosa karena memiliki kemampuan untuk menampung fragmen yang lebih besar dan bertindak sebagai medium penyongkong dalam proses elektroforesis. Kecepatan migrasi suatu molekul bergantung pada muatan listrik, massa DNA, dan titik isoelektrik. Gel elektroforesis yang sering digunakan adalah gel poliakrilamida berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer. Pada percobaan ini digunakan, gel agarosa karena gel agarosa mampu untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran besar. Proses running elektroforesis DNA sampel bersamaan dengan DNA yang telah diketahui ukurannya dapat berguna dalam analisis. Fungsi TAE adalah sebagai running buffer dan merupakan buffer umum digunakan sebagai buffer elektroforesis karena memiliki kapasitas buffering yang tinggi pada titik isoelektriknya. Tae buffer mengandung komposisi di dalam pembuatannya, yakni: Tris-asetat, EDTA, pH 8. Tri-asetat berfungsi untuk membuat DNA tetap berada dalam bentuk bermuatan negatif. Fungsi EDTA adalah sebagai pengikat-pengikat logam dan menonaktifkan DNAse, yakni enzim pemutus DNA. Loading buffer berfungsi untuk membantu proses sampel DNA turun ke dalam well dan bromfenol berfungsi untuk melihat jalannya elektroforesis dan sebagai pewarna. Sukrosa berfungsi untuk pemberat agar sampel DNA tenggelam ke dasar gel dan tidak melayang keluar. DNA yang akan dielektroforesis pada umumnya dicampur dengan loading dye yang berfungsi untuk memonitor mobilitas elektroforesis. Loading dye bermigrasi bersama molekul DNA selama proses runnning elektroforesiss. Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil
amplifikasi. Marker DNA yang berda pada elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul. Metode elektroforesis sebagai berikut:
Pada percobaan ini digunakan EtBr, dimana EtBr adalah senyawa mutagenik dan karsinogenik sehingga harus berhati-hati di dalam menggunakannya. EtBr berfungsi sebagai pewarna fluoresensi digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur semi-kualitatif fragmen DNA yang terseparasi dalam gel. EtBr ini akan terikat diantara dua untai ganda DNA sehingga band DNA dalam gel agarosa akan berpedar karena pewarna ini mengandung zat fluresence. Intensitas fluoresence dapat diukur dengan menggunakan DNA marker standard sehingga diperkirakan kuantitas DNANya. Kontrol negatif berfungsi untuk mengetahui kondisi reagen sehingga pada hasil elektrolisis seharusnya tidak diperoleh suatu pita DNA. Kontrol positif berfungsi untuk mengetahui pita yang merupakan pita DNA sampel karena DNA kromosom yang digunakan sudah diisolasi sebelumnya sehingga seharusnya pada hasil elektroforesis diperoleh suatu pita DNA. Didalam kontrol positif dimasukkan DNA komosom sehingga sampel yang di analisis di PCR akan teramplikasi dan muncum. Sedangkan kontrol negatif dimasukkan ddH2O, sampel yang diketahui apabila di PCR harusnya tidak akan muncul. Apabila kontrol positif tidak muncul maka ada yang salah pada alat PCR, mungkin master mix kappa yang dibuat ada yang salah, enzimnya tidak masuk atau enzim yang digunakan udah rusak dan sebagainya. Jika kontrol negatif yang muncul berarti sampelnya terkontaminasi. Pada percobaan ini, digunakan EtBr. EtBr adalah senyawa mutagenik dan karsinogenik
sehingga harus berhati-hati di dalam menggunakannya. EtBr berfungsi sebagai pewarna fluoresensi digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur semi-kualitatif fragmen DNA yang terseparasi dalam gel. EtBr ini akan terikat diantara dua untai ganda DNA sehingga band DNA dalam gel agarosa akan berpedar karena pewarna ini mengandung zat fluresence. Intensitas fluoresence dapat diukur dengan menggunakan DNA marker standard sehingga diperkirakan kuantitas DNANya. Dari hasil elektroforesis agarosa diperoleh pita DNA untuk kontrol positif dan marker pita DNA yang tidak terlalu jelas. Untuk kontrol negatif pita DNA tidak muncul sehingga kontrol negatif tidak terkontaminasi air pada saat ditambahkan. Sedangkan untuk sampel 1 dan sampel 2 tidak di peroleh pita DNA sehingga tidak dapat dilakukan analisis. Hal tersebut dapat dikarenakan lisis sel yang dilakukan memberikan hasil yang tidak maksimal sehingga sampel tidak diperoleh dan tidak dapat dihitung massa molekul DNA. Sejak tahun 1985, PCR telah banyak digunakan dalam penelitian biologis kedokteran, sosial, dan hukum. PCR digunakan untuk mendeteksi pelaku kejahatan dari sampel DNA air mani, darah, atau jaringan tubuh pelaku lainnya atau PCR digunakan untuk mendeteksi patogen yang sulit terdeteksi, sperti DNA virus HIV (Ratnasari, 2007). Identifikasi Penyakit Genetika untuk mengetahui segmen DNA dari pasien yang menderita penyakit mutasi genetika. Teknik ini dapat dilakukan dengan segmen dari DNA genom yang tidak diketahui secara lengkap atau hanya untaian tunggal dari genom tersebut. PCR memiliki banyak cara untuk mrngkloning DNA secara tradisonal. PCR dapat mengekstrak segmen untuk menyisipkan sebuah vektor dari genom yang memiliki ukuran besar yang hanya tersedia dalam jumlah yang sedikit. Aplikasi yang menarik dari PCR adalah analisis DNA dari fosil, seperti fosil Gajah purba di belanda. Aplikasi PCR digunakan dalam mempelajari susubab dari ekspresi gen. Jaringan (sel tunggal) dapat di analisa pada tahap berbeda untuk melihat gen mana yang telah aktif atau yang telah dimatikan. Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian
tubuh manapun kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidikjari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud. Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu. Dengan adanya penemuan dan manfaat teknik PCR ini berdampak sangat luas terhadap kemajuan sains dan teknologi secara umum adalah untuk memperkuat gen spesifik sebelum diklon, membuat fragmen gen DNA secara berlimpah, dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi, dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami kelainan sebelum dilahirkan, mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk mengetahui dari mana spesies tersebut berasal dan melacak asal usul seseorang dengan membandingkan “finger print". Kelebihan PCR adalah memiliki spesifisitas tinggi, sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama, dapat membedakan varian mikroorganisme, mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup, mudah di set up dan sebagainya. Sedangkan kelemahan PCR adalah sangat mudah terkontaminasi, biaya peralatan dan reagen mahal, interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi (misalnya infeksi pasif atau laten), Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus untuk melakukannya. Jenis PCR, teknik PCR dapat dimodifikasi ke dalam beberapa jenis diantaranya: 1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), metode ini digunakan untuk membedakan organisme berdasarkan analisis model derifat dari perbedaan DNA. 2. Inverse-PCR, metode ini digunakan ketika hanya satu sekuen internal yang diketahui. Template didigesti dengan enzim restriksi yang memotong bagian luar daerah yang akan diamplifikasi, fragmen restriksi yang dihasilkan ditempelkan dengan ligasi dan diamplifikasi dengan menggunakan sekuen primer yang memiliki titik ujung yang memiliki jarak yang jauh satu sama lain dengan segmen eksternal yang telah tergabung.
Metode ini khusus digunakan untuk mengidentifikasi ”sekuen antara” dari beragam gen. 3. Nested-PCR, proses ini memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi pada produk selama amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak diperlukan. Dua set primer digunakan untuk mendukung metode ini, set kedua mengamplifikasi target kedua selama proses pertama berlangsung. Sekuens DNA target dari satu set primer yang disebut primer inner disimpan di antara sekuens target set kedua dari primer yang disebut sebagai outer primer. Pada prakteknya, reaksi pertama dari PCR menggunakan outer primer, lalu reaksi PCR kedua dilakukan dengan inner primer atau nested primer menggunakan hasil dari produk reaksi yang pertama sebagai target amplifikasi. Nested primer akan menyatu dengan produk PCR yang pertama dan menghasilkan produk yang lebih pendek daripada produk yang pertama. 4. Quantitative-PCR digunakan untuk pengukuran berulang dari hasil produk PCR. Metode ini secara tidak langsung digunakan untuk mengukur kuantitas, dimulai dari jumlah DNA, cDNA, atau RNA. Hasil dari metode ini juga menampilkan copy dari sampel 5. Reverse Transcriptase (RT-PCR), metode ini digunakan untuk amplifikasi, isolasi atau identifikasi sekuen dari sel atau jaringan RNA. Metode ini dibantu oleh reverse transcriptase (mengubah RNA menjadi cDNA), mencakup pemetaan, menggambarkan kapan dan dimana gen diekspresikan. 6. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) bertujuan untuk mendeteksi polimorfisme pada tingkat DNA. Metode ini dikembangkan oleh Welsh and Mc Clelland (1990) dengan cara mengkombinasikan teknik PCR menggunakan primer – primer dengan sequens acak untuk keperluan amplifikasi lokus acak dari genom. PCR adalah teknologi canggih yang dapat mendeteksi DNA dengan cara amplifikasi DNA. Hasil pemeriksaan PCR dapat membantu untuk menegakkan diagnosa sepanjang pemeriksaan tersebut dikerjakan dengan cara yang benar dan sesuai dengan standar internasional. Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi. Hal ini didasarkan atas spesifitas, efisiensi dan keakuratannya. Masalah yang berkenaan dengan PCR yaitu biaya PCR yang masih tergolong tinggi. 4. KESIMPULAN Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan diperoleh isolasi dan perbanyakan fragmen gen 16S rDNA dari koloni tunggal dengan metode
Polymerase Chain Reaction (PCR) tidak berhasil dilakukan karena tidak dihasilkan pita DNA secara jelas dan adanya kontrol negatif yang muncul, sehingga massa molekul dari DNA tersebut tidak dapat ditentukan. DAFTAR PUSTAKA Alaeddini, R., 2012. Forensic implications of PCR inhibition—a review. Forensic Science International: Genetics, 6(3), pp.297-305. Clarridge, J.E., 2004. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical microbiology reviews, 17(4), pp.840-862. Gibson, N.J., Newton, C.R. and Little, S., 1997. A colorimetric assay for phosphate to measure amplicon accumulation in polymerase chain reaction. Analytical biochemistry, 254(1), pp.18-22. Giasuddin, A.S.M., 1995. Polymerase chain reaction technique: fundamental aspects and applications in clinical diagnostics. Journal of Islamic Academy of Sciences, 8(1), pp.29-32. Mayo, D.W., Pike, R.M. and Forbes, D.C., 2010. Microscale organic laboratory: with multistep and multiscale syntheses. John Wiley & Sons. Metzker, M.L. and Caskey, C.T., 2009. Polymerase chain reaction (PCR). eLS. Nurachman, Z., Kono, A., Radjasa, O.K. and Natalia, D., 2010. Identification a novel rawstarch-degrading-α-amylase from a tropical marine bacterium. American Journal of Biochemistry And Biotechnology, 6(4), pp.300306. Handoyo, D. and Rudiretna, A., 2000. Prinsip umum dan pelaksanaan polymerase chain reaction (PCR) [general principles and implementation of polymerase chain reaction]. Unitas, 9(1), pp.17-29. Jackson, C.R., Roden, E.E. and Churchill, P.F., 2000. Denaturing gradient gel electrophoresis can fail to separate 16S rDNA fragments with multiple base differences. Mol Biol Today, 1(2), pp.49-51. Madigan MT, Martinko JM, Brock TD. 2006. Brock Biology of Microorgnisms. NewJersey: Pearson Prentice Hall. Rahayu, N., 2013. Perancangan Primer untuk Pengembangan Sistem Deteksi Berbasis PCR (Polymerase Chain Reaction) pada Ganoderma spp. Ramakers, C., Ruijter, J.M., Deprez, R.H.L. and Moorman, A.F., 2003. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neuroscience letters, 339(1), pp.62-66.
Rinanda, T., 2011. ANALISIS SEKUENSING 16S rRNA DI BIDANG MIKROBIOLOGI. Jurnal Kedokteran Syiah Kuala, 11(3), pp.172-177.
