INFORME Nº7: TECNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS
I.
INTRODUCCION
En todos los ambientes naturales habitan múltiples microorganismos de diversos tipos que tienen distintas necesidades nutritivas basadas en mecanismos de síntesis propios y rutas metabólicas. Los fotótrofos usan la luz mientras que los quimiótrofos usan compuestos químicos. Para efectuar el estudio de un organismo particular es necesario separarlo de la población mixta en la que se encuentra. Para tal fin se emplean técnicas de aislamiento que conduzcan a la obtención de un cultivo puro. Los dos métodos de aislamiento físico de los microorganismos más comunes son: por diluciones seriadas y siembra por vertido en placa, y siembra por agotamiento. Otros métodos son la utilización de medios de cultivos selectivos y diferenciales basándose en el aprovechamiento de características particulares de los microorganismos, tales como la formación de esporas, el metabolismo anaerobio y/o facultativo, la capacidad para utilizar sustratos poco comunes, etc. Estos métodos pueden combinarse dependiendo de los microorganismos que se puedan encontrar en el ambiente y del microorganismo que se quiera separar por medio de sus necesidades nutritivas y de su medio óptimo de crecimiento.
II.
OBJETIVOS Observar las características de crecimiento de los microorganismos al trasplante en medios de cultivo líquidos y sólidos. Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismos, utilizando técnicas de aislamiento.
III.
MATERIALES Y METODOS
EJERCICO Nº1: “Técnicas de cultivo crecimiento en medio de cultivo”.
microorganismos: Características
de
Materiales: -
de
Cultivo de microorganismos (muestra de E.coli) Asa de kölle Mechero Tubos de agar nutritivo inclinado Tubos de agar nutritivo vertical Tubos con caldo nutritivo
Procedimiento: 1. Se Esterilizó el asa de kölle por flameo a la llama. 2. Se tomó el tubo con el cultivo de 18 horas, se retiró el tapón, se flameó la boca del tubo al mechero y se obtuvo una pequeña porción del cultivo con ayuda del asa de kölle. Se flameó la boca del tubo antes de volver a taparlo. 3. Se tomó el tubo con caldo nutritivo, y con los mismos cuidados anteriores se introduzco el asa en el líquido para dejar el inóculo. Se Homogenizó la mezcla girando el tubo entre las palmas de la mano. 4. Se repitió el procedimiento 1 para obtener más inóculo, pero usando esta vez aguja de kölle. 5. Se tomó el tubo con agar inclinado y se realizó la siembra depositando el inóculo a lo largo de una sola línea descrita desde la base de la inclinación hasta el extremo. 6. Se repitió el procedimiento1 para obtener inóculo, usando nuevamente aguja de kölle. 7. Se tomó el tubo con agar vertical y se realizó la siembra por picadura profunda del medio. 8. Se rotuló los datos sembrados y se puso a incubar a 37ºC por 24horas.
EJERCICO Nº2: “Técnicas de cultivo de microorganismos: Aislamiento y Recuento de placas”.
Materiales: - Tubos con caldo conteniendo una mezcla de microorganismos (Bacillus sp, Escherichia coli, Staphylococcus sp) - Asa de kölle, aguja de kölle - Mechero - Tubos con 12 ml de agar nutritivo licuado y mantenido a 50° C - Placas petri esteriles - Placas con agar nutritivo - Placas con agar Mc Conckey
Procedimiento:
A) Aislamiento por estrías o por agotamiento en superficie
1.
2.
3. 4. 5. 6.
Se tomó de la mezcla de caldo (caldo de microorganismos), con la ayuda del asa de kölle/ aguja de kölle un inóculo. (para este paso se consideró todas las condiciones de trabajo en asepsia) Se tomó la placa de agar nutritivo con la mano izquierda y con la ayuda de los dedos pulgar e índice levante hacia un lado la tapa, procurando que la parte expuesta se encuentre bajo la influencia de la llama del mechero. Con el asa cargada de inóculo, se hizo estrías sobre toda la superficie del medio. Se cerró la tapa. Se esterilizó el asa a la llama nuevamente. Se repitió los pasos para el medio agar Mc Conckey Colocar las placas en incubación a 37°C por 24 horas. Se observó el desarrollo de colonias individuales y se describió las características.
B) Aislamiento por diluciones sucesivas o siembra por incorporación
1.
Se tomó el tubo de caldo conteniendo la mezcla de microorganismos y con la ayuda del asa de kölle retirar un inoculo.
2.
Se tomó el primer tubo de agar licuado y se mantuvo la temperatura a 50°C y se transfirió asépticamente el inoculo. Se esterilizó el asa a la llama del mechero. Con el tubo cerrado se mezclo el inoculo con el medio, haciéndolo girar entre las palmas de las manos.
3.
Se transfirió una asada del agar mezclado con el inoculo hacia un segundo tubo de agar licuado. Se repitió la operación anterior para obtener una mezcla homogénea.
4.
Se vertió el contenido de cada tubo por separado en dos placas petri estériles y se rotaron lentamente para distribuir el medio de manera uniforme. Se Identificó cada dilución.
5.
Se Incubó las placas a 37°C por 24 horas.
Se Examinó el crecimiento de las colonias en las placas. Se hizo un recuento de las colonias, se describió las características diferenciales de las colonias observadas
IV.
MARCO TEÓRICO
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axénico, cuando contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso para obtener un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio sólido o líquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Un clon está constituido por una población de células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido. Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar. El aíre y todas las superficies están densamente pobladas por microorganismos, por lo tanto en la transferencia de una muestra microbiológica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminación. Estos incluyen el área de trabajo, el lavado de las manos, la esterilización de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona estéril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminación se le llama técnica aséptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como:
La contaminación y pérdida del cultivo en estudio La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría la contaminación de utensilios, productos y del personal. Este último aspecto es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patógenos.
Con relación a la concentración del inóculo, un error frecuente del principiante consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamaño de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa, será más que suficiente para efectuar una transferencia exitosa. Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta (para uso microbiológico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta Pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho. En la
transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación, hisopos, pipetas o pipetas Pasteur que deberán esterilizarse previamente. La utilización de estos dispositivos, así como de los diferentes medios de cultivo tiene aplicaciones específicas.
Un cultivo líquido puede ser transferido mediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta Pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y es fácil homogenizarlas, lo que permite estandarizar la concentración del inóculo. La desventaja que presentan, e que en ellos e difícil detectar contaminación a simple vista. Los medios semisólidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta Pasteur; en este último caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado líquido y a una temperatura de aproximadamente 42ºC se agrega el inóculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separación de microorganismos con diferentes requerimientos de oxígeno. Los medios sólidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades, después de esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de Petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentan características que varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado.
Siembra del Inoculo en Tubo
Siembra por estría en tubos con medio solido inclinado: Se toma con asa de siembra previamente esterilizado por flameado una cantidad de muestra adecuada. Se añade al tubo desde el fondo de la superficie de este, realizando movimientos ascendentes en zig-zag hasta completar toda la superficie del medio. Este método es utilizado para conservar cepas durante largos periodos, así como para la realización de ciertas bioquímicas, como, por ejemplo, la prueba de la ureasa.
Siembra por picadura: Se suele tomar con hilo de siembra aunque en ocasiones también pueden hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo semisólidos como por ejemplo, el medio de oxidación fermentación de Hugh-Leiffson.
Siembra del Inoculo en Placa
Aislamiento en estría: Se tomará con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) una cantidad adecuada de muestra problema depositando el inoculo en uno de los extremos superiores de la placa; a partir de aquí se realizaran movimientos en zig-zag de un extremo a otro de la placa no tomándose en ningún momento nuevo inoculo y no levantándose el asa hasta concluir la siembra de toda la placa.
Técnica de siembra por dilución: Se dispondrá de una batería de tubos con medio de cultivo específico o agua estéril según los casos. Se adicionara una
cantidad de muestra solida o liquida en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o inoculo que se añade en el tubo inicial. Se agitara hasta homogenización. Con pipeta estéril se tomara una cantidad específica o exacta y se adicionara al segundo tubo, que se homogeniza. Repetimos la operación anterior con el tercer tubo y así sucesivamente hasta obtener la dilución deseada. Con la dilución esperada, por ejemplo, 10 -3 y 10-4, inocular en placas de cultivo una cantidad de inoculo exacta y extender con un asa ce Digrasky previamente estéril. Incubar a temperatura precisa durante unas 24 horas y posteriormente recontar. Existen muchas variaciones de este método. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo con agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se diluyen hasta obtener la dilución deseada; posteriormente son vertidos en placa y se deja solidificar. En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aun cuando la mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá el crecimiento del microorganismo de interés y la obtención del cultivo. Con este mismo propósito durante la incubación se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento óptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría de las veces están relacionadas con la de su hábitat natural. Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta 80ºC. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiológica o un baño de agua a temperatura constante, en tanto que para los microorganismos que presentan su crecimiento óptimo a temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a temperatura ambiente. En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con aíre seco, lo que determina la deshidratación de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por más de nueve días. Con relación a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en presencia de oxígeno atmosférico; los que sólo crecen en presencia de aíre se llaman aerobios obligados; los que sólo crecen en ausencia de oxígeno se denominan anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conoce como facultativos. Existe una cuarta categoría que comprende bacterias que requieren oxígeno, pero sólo lo utilizan cuando éste existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaerofílicos. El desarrollo de estos diferentes grupos e favorece mediante la agitación de los cultivos o mediante la exclusión de oxígeno para lo que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales. Las bacterias son organismos procarióticos, se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como parásitos, comensales o mutualistas. Fisiológicamente este grupo presenta características muy variables, hay bacterias móviles e inmóviles fotosintéticas y quimiotróficas, autótrofas y heterótrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas. En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño, morfología celular, forma de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y características culturales en medios líquidos y sólidos en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.
V.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Color de amarillento
Color del blanquecino
la
película:
precipitado
Formación de película, masa de células en la superficie del caldo, turbidez (opacidad), depósito de células en el fondo del tubo (si se agita, se re suspenden en el caldo).
Crecimiento filiforme
Crecimiento superficial y en profundidad (ambas a la vez)
Consistencia de crecimiento viscoso Cantidad: moderada Distribución en superficie: Uniforme
Imagen nº1: de izquierda a derecha, resultados de la siembra en caldo nutritivo, agar vertical y agar inclinado. Véase el crecimiento de microorganismos en cada una de las muestras.
-
En los experimentos de crecimiento en caldo, crecimiento en agar vertical y en agar vertical con picadura profunda, se observa el desarrollo de la E. coli tanto dentro del medio (agar) como en la superficie de este. Esto queda explicado por Behrman etal. (2004) quien dice que la E. coli es un microorganismo anaerobio facultativo, es decir, puede desarrollarse tanto con presencia de oxigeno como sin él, pero con mejor crecimiento en presencia de este. Asi en el experimento se notó que las capas superficiales eran más gruesas mientras las que estaban dentro del agar eran dispersas y de menor cantidad.
-
Con respecto al desarrollo en agar inclinado se observó un crecimiento filiforme.
la
Se observó el crecimiento de microorganismos, colonias circulares de un tono perla
Se observó crecimiento de microorganismos, colonias muy juntas y mal esparcidas, de coloración rojiza con un halo de color rojo más intenso.
Imagen nº2: de izquierda a derecha, agar manitol salado, agar Mc conkey - En el Agar Mac Conkey se observo varias colonias teñidas de un color rojo intenso. Ya que este medio es selectivo y diferenciado para enterobacterias fermentadoras de lactosa podemos afirmar que en la muestra problema (mezcla) habían bacterias Escherichia coli, pues esta tal como lo refiere Madigan (2006)es una enterobacteria fermentadora de lactosa, la cual se tiñe de rojo porque al fermentar la lactosa deja residuos ácidos que cambian el pH del medio, haciendo que el rojo neutro (indicador) vire y se intensifique. El halo que presentan se debe a la precipitación de las sales biliares, ingredientes del agar Mac Conkey. - En el Agar Manitol salado se pudo observar la presencia de unidades formadores de colonias (UFC), cabe resaltar que cada UFC puede proceder tanto de una sola célula como de un grupo de células del mismo tipo de microorganismo. Las UFC eran de color blanquecino, circulares y con un halo amarillento. El agar manitol salado es un medio selectivo y diferenciado para Staphylococcus aureus, por ello
se puede inferir que se trataba de esta bacteria. Las colonias estaban distribuidas en toda la placa, siguiendo la estría dibujada, pero en diferentes densidades, observándose una mayor descarga del inoculo en el inicio de la estría y UFC individuales en el final.
Se observó gran cantidad de puntos amarillentos
Se observó el crecimiento de microorganismos, pero en mucha menor densidad que la placa anterior. Se pudieron diferenciar algunas colonias, unas más grandes de un color lechoso y otras más pequeñas de color amarillento
Imagen nº3: resultados de diluciones sucesivas. De izquierda a derecha, primera dilucion y segunda dilucion.
Se realizaron solo dos diluciones utilizando como muestra una mezcla de microorganismos. Luego del periodo de incubación se observó en las placas Petri lo siguiente: -
En la primera placa con la primera dilución se observó una gran cantidad de UFC circulares, muy pequeñas y de color amarillento. En la segunda placa con la segunda dilución se observó una cantidad mucho menor de UFC, las cuales eran circulares, algunas de mayor tamaño que otras y con un color amarillento y crema más acentuado. También se observa una mayor separación entra las UFC.
La diferencia de tamaño entre unas colonias con otras se debe a que se trata de un medio de cultivo común (agar nutritivo), el cual permite el crecimiento de diversos microorganismos. Según un análisis cualitativo se observa claramente que las diluciones permiten obtener cada vez menos colonias y más separadas unas de otras.
VI.
CUESTIONARIO
EJERCICIO Nº1 1. ¿Por qué algunos microorganismos desarrollan en caldo un característico crecimiento tipo película? ¿Qué factores ambientales podrían alterar la formación de una película superficial? Según Koneman et al (2008) los microorganismos móviles muestran un crecimiento difuso lejos de la línea de inoculación, mientras que los inmóviles sólo muestran crecimiento a lo largo de la línea de corte. Además nos dice que para el establecimiento de la movilidad de microorganismos se utilizan medios semisólidos para permitir que el microorganismo se expanda. Si combinamos esto con el hecho de la existencia de microorganismos que necesita la presencia de oxígeno para su crecimiento podemos encontrar una razón para el crecimiento tipo película en el caldo (Cultivo no sólido). MAD (2002, editor) confirma esto al mencionarnos al V. cholerae cuyo aislamiento se basa en el rápido crecimiento de este microorganismo sobre agua de peptona alcalina (Caldo de cultivo) en condiciones de aerobiosis y nos recalca que el crecimiento de este microorganismo se manifiesta con la formación de una película en la superficie del medio luego de pocas horas de incubación. Forbes (2009) nos pone otros ejemplos al mencionarnos al Proteus mirabilis, P. penneri y P. vulgaris, quienes presentan un crecimiento tipo enjambre en agar sangre y agar chocolate, cuya diseminación da como resultado una superficie delgada de crecimiento sobre la superficie del agar. Por dicha razón uno de los factores ambientales más importantes para el desarrollo de dicha película es la composición del aire, especialmente la proporción de oxígeno presente en este ya que debe ser suficiente para el crecimiento de microorganismos. Por otro lado se deben tener condiciones que permitan dicho desarrollo como una temperatura apropiada, pH del medio, niveles de radiación escasos. Según vayan variando estos factores se limitará la presencia de ciertos microorganismos en el cultivo y, si son extremos, no habrá ningún microorganismo salvo los extremófilos que sean capaces de habitarlo.
2. Cuando utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las características de crecimiento es preferible inocular con aguja de kölle y no con asa. ¿Por qué? Para observar las características de crecimiento en agar inclinado es importante el uso de aguja de kölle pues se desea realizar una punción profunda para observar cómo se extienden los microorganismos al crecer. Por este propósito es aconsejable el uso de una aguja de köller al representar un punto de inoculación estrecho que permita observar los ligeros cambios en la expansión del cultivo, si se utilizara el asa de kölle se tendría una zona y no un punto de inoculación dando como resultado un posible error al observar el crecimiento dado que no se posee
una línea inicial de aplicación de microorganismos, sino un área. Mac Faddin (2003) nos dice esto y afirma que en un medio de agar inclinado el proceso de inoculación debe hacerse primero realizando una estría en el pico de flauta y luego una punción en el fondo del tubo.
3. ¿Qué factores influenciarán en la abundancia del crecimiento en caldo, agar inclinado y agar vertical? De la Rosa y Prieto (2003) nos dicen que entre los principales factores que determinan el crecimiento microbiano podemos encontrar los siguientes:
Agua: Requerimiento absoluto para el crecimiento bacteriano debido a que al menos el 80% de la masa de estas es agua, por lo que la disponibilidad de esta condiciona el tamaño de las poblaciones bacterianas.
Oxígeno: Las bacterias difieren en sus necesidades de oxígeno. Así se pueden separar en aerobias (Crecen en una atmósfera con presencia de 21% de oxígeno), anaerobias (Crecen en ausencia de oxígeno), aerobias estrictas (No pueden crecer en anaerobiosis), anaerobias estrictas (No crecen en aerobiosis) y facultativas (Crecen en aerobiosis y anaerobiosis), finalmente las que son incapaces de utilizar oxígeno como aceptor final en su respiración pero pueden crecer en presencia de oxígeno se llaman aerotolerantes. Así el tipo de bacteria determina la composición del aire del medio de cultivo. Además esta necesidad influye, en ciertas ocasiones, en la virulencia de las bacterias y en las enfermedades que producen.
Anhídrido carbónico: Muchas bacterias patógenas, como los meningococos, requieren un contenido de 5 a 10% de CO2 en la atmósfera.
Temperatura: Las bacterias también difieren en su temperatura óptima de crecimiento. Así tenemos psicrófilas (Debajo de 20ºC), mesófilas (Entre 20 y 40ºC) y termófilas (Entre 55 y 80ºC), siendo la mayoría de bacterias patógenas mesófilas y crecen mejor a temperaturas alrededor de 37ºC (Temperatura del cuerpo humano)
pH: El pH afecta mucho el desarrollo óptimo de las bacterias. En el caso de las que producen enfermedades en el hombre éste punto está en el pH fisiológico (7,2)
Productos metabólicos bacterianos: Las bacterias sintetizan estructuras y las transportan a donde corresponda, algunas de las cuales son de gran interés.
Por otro lado, Tortora et al (2007) nos menciona los parámetros que deben tenerse en cuenta en los medios de cultivo para el desarrollo adecuado de los microorganismos. Entre estos está la presencia de una fuente de energía, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y cualquier otro factor de crecimiento que el organismo no pueda sintetizar. EJERCICIO Nº2 1. ¿Qué procedimiento seguiría a continuación del desarrollado en estos ejercicios para obtener el cultivo puro de cada cepa contenida en la mezcla? ¿Cómo podríamos comprobar que estas cepas obtenidas finalmente corresponden a las colonias aisladas? Luego de los métodos de aislamiento se obtienen colonias diferenciadas e individuales de diferentes tipos de microorganismos. Estas pueden ser purificadas.
Para esto se selecciona la colonia cuya cepa se desee obtener en estado puro. Esta es trasplantada a otra placa de agar mediante el método de agotamiento de superficie y el uso de la aguja de kölle. En este medio se le darán las condiciones de cultivo indicadas para la proliferación de microorganismos (37ºC por 24 horas). Tiempo después se volverá a obtener una placa petri con presencia de microorganismos y colonias individuales, pero en esta placa se presentará una mayor presencia de la colonia seleccionada si la inoculación se realizó de la forma correcta. Este proceso se ha de repetir hasta obtener la totalidad de colonias de la especie deseada y puede realizarse para todas los cultivos cuyas cepas se deseen obtener. Para comprobar que estas cepas provienen de las colonias aisladas se realizaría un análisis y comparación macroscópica y luego microscópica de un cultivo proveniente de la cepa pura y de las colonias originales presentes en el primer agar Mac Conkey. Así se comprueba gracias a las características, microscópicas principalmente, si son o no de la misma especie y, por lo tanto, de las colonias aisladas del inicio.
2. ¿Qué factores limitan el tamaño de las colonias en una placa de cultivo? Alarcón (2004) nos dice que existen ciertos factores limitantes del crecimiento microbiano cuyo conocimiento es importante para su control, entre estos están:
Temperatura óptima de crecimiento de algunas bacterias: La temperatura ambiental afecta directamente el funcionamiento de las enzimas bacterianas siendo la temperatura óptima de crecimiento aquella en la cual el microorganismo se multiplica a su máxima velocidad.
Influencia de la presión osmótica: El crecimiento bacteriano es afectado grandemente por la cantidad de agua que entra o sale de la célula, especialmente cuando se encuentra la bacteria en una solución hipertónica debido a que se inhibe su crecimiento. Este grado de inhibición depende del tipo de soluto y de la naturaleza del organismo.
pH
Luz ultravioleta
Por su parte, Pumarola y Pumarola (1995) nos dicen que cuando se utilizan como inóculo células en estado metabólico latente, son factores de importancia crítica para iniciar el crecimiento el pH, la temperatura, la presencia de concentraciones adecuadas de oxígeno (Potencial de oxidación-reducción) y concentraciones favorable de CO2, además de ciertas sustancias nutritivas, en especial las que se producen lentamente o con dificultad por sí mismas.
3. Suponga que recibe una muestra de leche en polvo y se le pide determinar el número total de colonias por gramo. Plantee una metodología cuantitativa basada en diluciones sucesivas para resolver el problema. En primer lugar se alistarían 10 tubos con 9 mL de agar licuado, manteniéndolos en este estado mediante calor. Posteriormente en un décimo tuvo se realizaría la disolución de 1 gramo de muestra en 9 mL de agua destilada de alta pureza. Se homogeniza y posteriormente se extrae una alícuota de 1 mL y se agrega al primer
tubo de agar licuado. Luego se homogeniza y se extrae una alícuota de 1 mL de este para agregarlo al siguiente y así sucesivamente. Posteriormente se vacían los contenidos de los tubos, cada uno a una placa petri y se llevan a incubar a 37ºC por 24 horas. Tiempo luego del cual se procede al recuento de colonias al microscopio tomándose como valor aceptable aquel que oscile entre 30 y 300. Luego de esto se extrapola este número hasta llegar a la concentración de bacterias en el gramo de muestra utilizado y ya se tendría el número de colonias por gramo de la muestra de leche en polvo.
4. ¿En qué consiste la técnica del número más probable? ¿Qué usos tiene? MAD (Editor, 2006) nos dice que la técnica del número más probable (NMP) es un método estadístico basado en la dispersión aleatoria de los microorganismos en un volumen de agua determinado, es decir, muestras repetidas del mismo tamaño de un mismo producto, por lo que cabe esperar que contengan el mismo número de microorganismos como promedio. Esta cifra media estimada es el Número Más Probable. De esta forma, si un líquido posee 100 microorganismos en 100 mL, cada muestra de 10 mL debería contener 10 microorganismos; la de 1 mL, 1 microorganismo y la de 0,1 mL solo 1 microorganismo cada 10 muestras. Por dicha razón si se siembran varios tubos de medio con muestras de distinto volumen es posible calcular el NMO de microorganismos en 100 mL de medio con cualquier combinación de resultados obtenidos de las muestras. La siembra se realiza por triplicado o quintuplicado. Tras incubar se observa turbidez, cambio de color o producción de gas, según los casos, obteniéndose un valor numérico que, a través de las tablas, indica la cifra más probable de microorganismos en la muestra, sobre la base del número de tubos que manifiestan resultado positivo. Existen tablas para muestras de 10 mL, 1 mL y 0,1 mL. En la determinación existen tres fases: Presuntiva, confirmativa y de análisis completo. Además permite el procesamiento de muestras claras o turbias. Sin embargo, existen ciertos inconvenientes como no proporcionar un recuento preciso, sino una estimación estadística de la presencia de un determinado microorganismo; la necesidad de múltiples tubos de fermentación y el tiempo de espera entre 5 y 7 días.
5. ¿De qué manera se pueden preservar cepas puras por largos periodos? Se puede proveer al medio de un ambiente externo estéril, colocar a las cepas puras en un cultivo dentro de una placa petri o tubo, este cerrado y colocarlo en una cámara estéril o donde se realice vacío. IICA (1985) nos dice que otra forma de conservación del material biológico, ya sea en tubos o cajas de petri conteniendo medio de cultivo sólido, para que la célula no sufra cambios por deterioro, puede darse por un sistema de perlas, que consiste en adherir a perlas de vidrio suspensión de bacterias, o conservarlas en forma liofilizada (Actividad de agua baja)
6. ¿Qué técnicas anaeróbicos?
de
cultivo
se
emplean
para
aislar
microorganismos
Koneman et al (2008) nos dice que antes del aislamiento de cultivos es necesario un reconocimiento de posibles especies presentes. Esto se realiza mediante el uso de distintos cultivos, como el agar sangre, en el cual crecen muy bien los anaerobios estrictos como Clostridium novyi y Clostridium haemolyticum. Menciona además la técnica de selección de esporas como método de aislamiento para Clostridium sp. y cultivos anaerobios en general. Luego menciona métodos con fines especiales para el aislamiento primario de anaerobios en la flora normal descritos en el Manual Madsworth, medios selectivos y una técnica de enriquecimiento en frío para ayudar al aislamiento de especies de Mobiluncus sp. en muestras vaginales por Smith y Moore, un medio diferencial y selectivo para el aislamiento de Bacteroides ureolyticus. Por Eley y cols, un medio selectivo para Bacteroides gracilis realizado por Lee y cols, un medio selectivo para el aislamiento de especies de Anaerobiospirillum sp. proveniente de heces, realizado por Malnick y cols; además menciona medios selectivos adicionales con fines especiales y procedimientos para el aislamiento y la cuantificación de Clostridium difficile, c. perfringens y C.botulinum de heces o muestras de alimentos. VII.
CONCLUSIONES
Se puede hacer una distinción de la presencia de microorganismos en un medio líquido por la turbidez que presenta este una vez contaminada. En este medio existe una numerosa cantidad de géneros y especies de microorganismos ya que el caldo nutritivo es un medio no discriminativo.
En la aislación de microorganismos en el agar manitol salado podemos concluir que hubo proliferación exitosa de bacterias del genero Staphylococcus ya que este medio es diferencial porque esta compuesto por nutrientes específicos para ese genero de bacterias además de tener una alta conc. salina.
La aislación de bacterias en agar Mac Conkey se realizó con éxito. Este medio es selectivo y diferencial que se emplea más a menudo para la aislación de enterobacterias siendo el más común E-coli; contiene violeta cristal para inhibir el crecimiento de cocos gran positivos y rojo neutro como indicador de pH, que le otorga propiedades diferenciales. Los fermentadores de lactosa producen ácidos orgánicos que disminuyen el pH de medio próximo a la colonia. En esa zona el rojo neutro vira al rojo o rosado. Los no fermentadores de lactosa permanecen incoloros y translúcidos. Se puede concluir que el microorganismo aislado es Escherichia coli. En un aislamiento por diluciones se obtiene el recuento de las colonias, las cuales permitirán conocer el número de células existentes en el cultivo original.
VIII.
BIBLIOGRAFÍA
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