LAPORAN PRAKTIKUM
ANATOMI FISIOLOGI TUMBUHAN
Penentuan Kadar Klorofil Secara Spektroskopi
NAMA : NIA WIDYARSIH
NIM : F05112062
KELAS B REG A
PRODI PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS TANJUNGPURA
PONTIANAK
2014
ABSTRAK
Fotosintesis hanya dapat berlangsung jika ada klorofil. Hal ini dapat kita lihat pada spektrum absorbsi. Bentuk spektrum absorbsi klorofil tidak banyak berbeda dengan spektrum absorbsi fotosintesis. Cahaya merah dan biru merupakan dua jenis cahaya yang efektif dalam fotosintesis. Untuk memperoleh spektrum absorbsi, pertama pigmen klorofil di ekstraksi, kemudian dengan spektrofotometer di tentukan nilai absorbannya pada panjang gelombang tertentu. Warna daun berasal dari klorofil, pigmen warna hijau yang terdapat di dalam kloroplas. Energi cahaya yang diserap klorofil inilah yang menggerakkan sintesis molekul makanan dalam kloroplas. Klorofil merupakan molekul organik yang kompleks. Didalam tumbuhan terdapat 2 jenis klorofil yaitu klorofil a dan b. Klorofil a merupakan klorofil yang paling efektif dalam proses fotosintesis karena memiliki warna biru-hijau yang merupakan warna yang paling efektif dalam fotosintesis. Daun setengah tua memiliki kadar klorofil yang lebih tinggi dibandingkan daun dewasa dan muda karena pada daun setengah tua ini memiliki jaringan yang telah sempurna, sehingga penyerapan cahaya dan air menjadi lebih efektif. Berdasarkan hal tersebut, tujuan utama dari percobaan ini adalah untuk mempelajari dan memberikan latihan cara penggunaan spektrofotometer. Untuk keperluan ini, penentuan kadar klorofil adalah salah satu contoh dalam penggunaan spektrofotometer ini. Spektrofotometer yang akan digunakan dalam percobaan ini adalah BAUSCH & LOMB SPECTRONIC 20 SPECTROPHOTOMETER.
Kata kunci : Daun muda, Daun Setengah Tua, Daun Tua, Fotosintesis,Klorofil, Klorofil a dan b, Spektrofotometer
PENDAHULUAN
Warna daun berasal dari klorofil, pigmen warna hijau yang terdapat di dalam kloroplas. Energi cahaya yang diserap klorofil inilah yang menggerakkan sitesis molekul makanan dalam kloroplas. Kloroplas ditemukan terutama dalam sel mesofil, yaitu jaringan yang terdapat di bagian dalam daun. Karbon dioksida masuk ke dalam daun, dan oksigen keluar, melalui pori mikroskopik yang di sebut stomata (Campbell, dkk, 2002).
Klorofil adalah pigmen hijau fotosintetis yang terdapat dalam tanaman, Algae dan Cynobacteria. nama "chlorophyll" berasal dari bahasa Yunani kuno: choloros = green (hijau), and phyllon= leaf (daun). Fungsi krolofil pada tanaman adalah menyerap energi dari sinar matahari untuk digunakan dalam proses fotosintetis yaitu suatu proses biokimia dimana tanaman mensintesis karbohidrat (gula menjadi pati), dari gas karbon dioksida dan air dengan bantuan sinar matahari (Subandi, 2008).
Klorofil merupakan zat hijau daun yang terdapat pada semua tumbuhan hijau yang berfotosintesis. Berdasarkan penelitian, klorofil ternyata tidak hanya berperan sebagai pigmen fotosintesis. Proses fotosintesis membutuhkan klorofil, maka klorofil umumnya disintesis pada daun untuk menangkap cahaya matahari yang jumlahnya berbeda pada tiap spesies tergantung dari faktor lingkungan dan genetiknya. Faktor-faktor yang mempengaruhi sintesis klorofil meliputi: cahaya, gula atau karbohidrat, air, temperatur, faktor genetik dan unsur-unsur nitrogen, magnesium, besi, mangan, Cu, Zn, sulfur, dan oksigen.
Faktor utama pembentuk klorofil adalah nitrogen (N). Unsur N merupakan unsur hara makro. Unsur ini diperlukan oleh tanaman dalam jumlah banyak. Unsur N diperlukan oleh tanaman, salah satunya sebagai penyusun klorofil. Tanaman yang kekurangan unsur N akan menunjukkan gejala antara lain klorosis pada daun. Tanaman tidak dapat menggunakan N2 secara langsung. Gas N2 tersebut harus difiksasi oleh bakteri menjadi amonia (NH3) (Hendriyani dan Setiari, 2009).
Klorofil pada tumbuhan ada dua macam, yaitu klorofil a dan klorofil b. perbedaan kecil antara struktur kedua klorofil pada sel keduanya terikat pada protein. Sedangkan perbedaan utama antar klorofil dan heme ialah karena adanya atom magnesium (sebagai pengganti besi) di tengah cincin profirin, serta samping hidrokarbon yang panjang, yaitu rantai fitol (Santoso, 2004).
Semua tanaman hijau mengandung klorofil a dan krolofil b. Krolofil a terdapat sekitar 75% dari total klorofil. Kandungan klorofil pada tanaman adalah sekitar 1% basis kering. Dalam daun klorofil banyak terdapat bersama-sama dengan protein dan lemak yang bergabung satu dengan yang lain. Dengan lipid, klorofil berikatan melalui gugus fitol-nya sedangkan dengan protein melalui gugus hidrofobik dari cincin porifin-nya. Rumus empiris klorofil adalah C55H72O5N4Mg (klorofil a) dan C55H70O6N4Mg (klorofil b) (Subandi, 2008).
Antara klorofil a dan klorofil b mempunyai struktur dan fungsi yang berbeda, dimana klorofil a di samping bias menyerap energi cahaya, klorofil ini juga bias merubah energi cahaya dan tidak bisa merubahnya menjadi energi kimia dan energi itu akan ditransfer dari klorofil b ke klorofil a. Klorofil b ini tidak larut dalam etanol tai dapat larut dalam ester, dan kedua jenis klorofil ini larut dalam senyawa aseton (Devlin, 1975).
Ketika tingkat radiasi tinggi, biasanya kloroplas tersusun berbaris di sepanjang dinding radial sel, menjadi terlindung satu sama lain dari kerusakan akibat cahaya. Dalam cahaya redup dan sering dalam gelap, kloroplas terpsah menjadi dua kelompok yang tersebar di sepanjang dinding di sisi terdekat dan terjauh dari sumber cahaya; dengan demikian, memaksimumkan penyerapan cahaya. Pergerakan plastid ini, yang bergantung pada arah cahaya dan juga tingkat iradiansi, merupakan contoh adanya fototaksis.
Pada semua spesies, kloroplas itu sendiri tidak menyerap cahaya yang mengakibatkan fototaksis; sebaliknya, cahaya yang diserap di tampat lain di dalam sel menyebabkan pergerakan kloroplas melalui efeknya pada aliran sitoplasma, dan efek itu berasal dari interaksi antara mikrofilamen dan mikrotubul. Secara ekologis, pergerakan kloroplas tampak penting, terutama untuk meningkatkan penyerapan cahaya pada iradiansi rendah dan untuk mengurangi penyerapan ketika iradiansi tinggi sekali, yang mungkin akan menyebabkan solariasi atau perusakan lainnya oleh cahaya (Salisbury dan Ross, 1995).
Peningkatan kandungan klorofil a dan b menyebabkan kemampuan dalam menangkap energi radiasi cahaya klon toleran lebih efisien dibandingkan dengan klon peka, sehingga fotosintesis klon toleran lebih tinggi dibandingkan dengan klon peka. Klorofil a dan b berperan dalam proses fotosintesis tanaman. Klorofil b berfungsi sebagai antena fotosintetik yang mengumpulkan cahaya. Peningkatan kandungan klorofil b yang pada kondisi ternaungi berkaitan dengan peningkatan protein klorofil sehingga akan meningkatkan efisiensi fungsi antena fotosintetik pada Light Harvesting Complex II (LHC II). Penyesuaian tanaman terhadap radiasi yang rendah juga dicirikan dengan membesarnya antena untuk fotosistem II. Membesarnya antena untuk fotosistem II akan meningkatkan efisiensi pemanenan cahaya (Hidema et al., 1992).
Klorofil b berfungsi sebagai antena yang mengumpulkan cahaya untuk kemudian ditransfer ke pusat reaksi. Pusat reaksi tersusun dari klorofil a. Energi cahaya akan diubah menjadi energi kimia di pusat reaksi yang kemudian dapat digunakan untuk proses reduksi dalam fotosintesis (Taiz dan Zeiger, 1991).
Sejak tipe-tipe atom atau molekul yang sedikit berbeda pada tingkat energinya, yang substansi menyerap cahaya dengan suatu karakteristik panjang gelombang yang berbeda. Ini biasanya ditunjukkan selama penyerapan sinar pada tiap gelombangnya. Sebagai contoh, klorofil a sangat kuat pada panjang gelombang 660 nm pada sinar merah dan paling rendah pada panjang gelombang 430 nm pada sinar biru. Ketika gelombang itu berpindah maka sinar yang ada di sebelah kiri adalah sinar hijau yang bisa kita lihat (Guiltmond and Hopkins, 1983).
Spektrofotometri sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrofotometer dan fotometer akan menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang energi secara relatif. Jika energi tersebut ditransmisikan maka akan ditangkap oleh klorofil yang terlarut tersebut. Pada fotometer filter sinar dari panjang gelombang yang diinginkan akan diperoleh dengan berbagai filter yang punya spesifikasi melewati banyaknya panjang gelombang tertentu. (Noggle dan Fritz, 1979).
Dari semua radiasi matahari yang dipancarkan, hanya panjang gelombang tertentu yang dimanfaatkan tumbuhan untuk proses fotosintesis, yaitu panjang gelombang yang berada pada kisaran cahaya tampak (380-700 nm). Cahaya tampak terbagi atas cahaya merah (610 - 700 nm), hijau kuning (510 - 600 nm), biru (410 - 500 nm) dan violet (< 400 nm). Masing-masing jenis cahaya berbeda pengaruhnya terhadap fotosintesis. Hal ini terkait pada sifat pigmen penangkap cahaya yang bekerja dalam fotosintesis. Pigmen yang terdapat pada membran grana menyerap cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Pigmen yang berbeda menyerap cahaya pada panjang gelombang yang berbeda (Pratama, 2009).
Alat Spektrofotometer sangat mahal, sehingga hanya sedikit tempat yang memilikinya. Penggunaan alat penunjang seperti cuvet, pemakaiannya juga harus dengan hati-hati. Untuk itulah, tujuan utama dari percobaan ini adalah untuk mempelajari dan memberikan latihan cara penggunaan Spektrofotometer. Untuk keperluan ini, penentuan kadar klorofil adalah salah satu contoh dalam penggunaan Spektrofotometer ini. Spektrofotometer yang akan digunakan dalam percobaan ini adalah Spektrophotometer UV-1800 V merk Rayleigh.
METODELOGI
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah bayam (Amaranthus sp), aseton 60% dan 80%. Dan alat yang digunakan berupa mortar dan alu, gelas ukur, labu ukur, tabung reaksi, spektrofotometer Genesys 10.
Untuk percobaan pengukuran kadar klorofil dilakukan percobaan mengukur kadar klorofil dari suatu tanaman yang umurnya berbeda-beda. Untuk memperoleh umur yang berbeda ini diambil patokan :
1. Daun umur muda diambil daunnya pada pucuk
2. Daun setengah tua diambil daun nomor 3 dari pucuk
3. Daun dewasa diambil daun nomor 5 ke bawah
Untuk membandingkan kadar klorofil dari daun-daun tadi digunakan cara pengukuran yang dilakukan oleh Arnon (1949) yaitu, 1 gram daun yang masih segar dirajang kecil-kecil. Rajangan diekstrak dengan aseton 60% sebanyak 100 mL, dengan cara menggerusnya didalam mortal selama 5 menit. Diyakinkan bahwa semua pigmen klorofil dari daun telah keluar seluruhnya dan hal ini dapat dilihat dari ampasnya yang berwarna putih. Ekstrak klorofil disaring dengan saringan Buchner dan selanjutnya dimasukan ke dalam labu ukur 100 ml. Penambahan aseton 80% hanya diperlukan apabila volume ekstrak dalam labu ukur belum mencapai batas 100 ml. Dengan menggunakan cuvet, Optica Dencity (OD) diukur dari ekstrak dengan menggunakan panjang gelombang 663 nm dan 645 nm. Konsentrasi klorofil dapat dihitung dengan rumus Arnon (1949) dengan membandingkan OD pada 663 nm dan 645 nm dalam sel yang tebalnya 1 cm dengan menggunakan koefisien absorbsi spesifik yang telah ditentukan oleh Mac Kinner (1941) sebagai berikut :
Klorifil total (mg/l) = 20,2 D645 + 0.02 D663
Klorofil a = 12,7 D663 + 2,69 D645
Klorofil b = 22,9 D645 + 0,02 D663
HASIL DAN PEMBAHASAN
Berikut adalah hasil pengamatan praktikum menggunakan spektofotometer
no
indeks
mode
A
B
663 nm
645 nm
1
0
Abs
0.000
0.000
2
0
Abs
0.472
0.221
3
0
Abs
0.594
0.218
4
0
Abs
0.615
0.240
1. Hasil pengamatan untuk kadar klorofil daun muda
No.
Jenis klorofil
Klorofil a
Klorofil b
Klorofil total
1.
6,58889
5,07034
4,47364
2. Hasil pengamatan untuk kadar klorofil daun setengah tua
No.
Jenis klorofil
Klorofil a
Klorofil b
Klorofil total
1.
8,13022
5,00408
4,41548
3. Hasil pengamatan untuk kadar klorofil daun dewasa
No.
Jenis klorofil
Klorofil a
Klorofil b
Klorofil total
1.
8,4561
5,5083
4,84603
Pada praktikum kali ini untuk penentuan kadar klorofil menggunakan daun bayam (Amaranthus spinosus) dengan umur yang berbeda yaitu daun umur muda yaitu daun yang diambil pada pucuk, daun setengah tua diambil daun nomor 3 dari pucuk, dan daun dewasa yaitu daun nomor 5 kebawah. Masing-masing daun tersebut diekstrak dan ekstrak tersebut dibiarkan selama 1 minggu. Setelah diekstrak, terlihat jelas perbedaan warna ekstrak dari daun yang berbeda usianya. Untuk warna ekstrak tercerah didapat pada daun setengah tua.
Selanjutnya dilakukan penentuan kadar klorofil dengan menggunakan alat yang disebut dengan spektrofotometer. Harga alat ini sangat mahal sehingga dalam penggunaannya perlu dilakukan secara hati-hati.
Untuk menggunakan alat tersebut pertama isi akuades pada cuvet yang nantinya akan dijadikan sebagai blanko, kemudian diletakkan pada spektofotometer dengan hati-hati dan selanjutnya ditekan tombol zero untuk mengkalibrasi alat tersebut. Selanjutnya isi cuvet lainnya dengan ekstrak daun bayam (Amaranthus spinosus) yang ada. Masukkan 1 cuvet berisi ekstrak daun bayam ditempat cuvet berisi akuades diletakkan sebelumnya sedangkan cuvet berisi akuades dipindahkan pada posisi diatas cuvet berisi ekstrak daun bayam. Lalu spektofotometer kembali dikalibrasi. Setelah pengkalibrasian selesai, maka dipilih panjang gelombang yang diinginkan yang tertera pada monitor spektrofotometer. Klorofil yang terkandung pada ekstrak daun bayam tersebut selanjutnya akan ditembakkan sesuai dengan panjang gelombang yang telah dipilih dan nantinya akan terlihat nilai kadar klorofil dari ekstrak daun bayam yang diukur pada monitor.
Prinsip kerjanya adalah menentukan kadar klorofil dengan spektrum cahaya (panjang gelombang) tertentu yang dipancarkan ke molekul klorofil didalam alat tersebut. Senyawa tertentu hanya menyerap foton yang bersesuaian dengan panjang gelombang tertentu dan oleh karena itu setiap pigmen memiliki spektrum absorbsinya yang unik. Klorofil a dan klorofil b karena memiliki absorbsi spektrumnya yang kuat pada kisaran panjang gelaobang 600-700 nm. Klorofil-a (C55H72O5N4Mg) yang berwarna hijau tua dan klorofil-b (C55H70O6N4Mg) yang berwarna hijau muda. Klorofil-a dan b paling kuat menyerap cahaya di bagian merah (600-700 nm), sedangkan yang paling sedikit cahaya hijau (500-600 nm).
Dari pengukuran kadar klorofil menggunakan alat Spektrofotometer, ternyata kadar klorofil pada daun tua memang lebih banyak yaitu 4,8603 mg/l dibandingkan dengan daun muda yaitu 4,47364 mg/l dan daun setengah tua yaitu 4,41548 mg/l.
Adapun rumus yang digunakan untuk menghitung klorofil total yaitu:
Klorofil Total (mg/l) = 20,2 D645 + 0,02 D663
Diperolehnya hasil tersebut dapat dikarenakan pada daun bayam berusia setengah tua memiliki kadar klorofil yang paling maksimal karena pada usia ini daun melakukan proses fotosintesis secara aktif sedangkan pada daun muda diperoleh hasil kadar klorofil terendah dikarenakan kadar klorofil yang terbentuk masih sedikit dan masih dalam proses pembentukan, selanjutnya pada daun dewasa kadar klorofilnya sudah sedikit berkurang dibandingkan dengan daun setengah tua. Hal ini dapat terjadi karena rusaknya klorofil yang ada.
Dari hasil percobaan juga diperoleh hasil bahwa dari ketiga ekstrak daun bayam dengan umur yang berbeda diperoleh kadar klorofil a lebih tinggi dibandingkan dengan kadar klorofil b. Hal ini sesuai dengan pernyataan Subandi (2008) bahwa Semua tanaman hijau mengandung klorofil a dan krolofil b. Krolofil a terdapat sekitar 75 % dari total klorofil.
Untuk menghitung klorofil a dan klorofil b menggunakan rumus:
Klorofil a = 12,7 D663 + 2,69 D645
Klorofil b = 22,9 D645 + 0,02 D663
Jadi setelah melakukan praktikum ini praktikan dapat mengetahui dan menggunakan spektofotometer sesuai prosedur yang benar dalam satu diantara kegunaanya yaitu penentuan kadar klorofil.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum Penentuan Kadar Klorofil secara Spektoskopi maka dapat disimpulkan bahwa kadar klorofil total tertinggi didapatkan pada ekstrak daun bayam (Amaranthus spinosus) yang berusia setengah tua sebesar 4,41548 mg/l. Sedangkan pada daun dewasa 4,8603 mg/l dan daun muda hanya 4,47364 mg/l
Selanjutnya diperoleh bahwa kadar klorofil a pada semua ekstrak daun bayam (Amaranthus spinosus) lebih tinggi nilainya dibandingkan dengan kadar klorofil b.
Pengukuran jumlah klorofil dapat dengan dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer BAUSCH & LOMB SPECTRONIC 20 SPECTOPHOTOMETER dan dibutuhkan keterampilan dan pengetahuan khusus dalam penggunaannya. Pada daun yang masih muda konsentrasi klorofil masih rendah, sedangkan daun setengah tua sangat tinggi dan menurun drastis pada daun dewasa akibat penuaan. Tingginya konsentrasi klorofil menunjukkan tingginya penyerapan energi cahaya oleh daun itu sendiri. Semakain tinggi penyerapan cahaya pada daun maka semakin maksimal kinerja dalam proses fotosintesisnya.
.
DAFTAR PUSTAKA
Campbell dkk. 2002 Biologi Edisi Kelima Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
Devlin, Robert M. 1975. Plant Physiology Third Edition. New York: D. Van Nostrand.
Djukti dan Purwoko, Bambang Sapta. 2003. Pengaruh Naungan Paranet Terhadap Sifat Toleransi Tanaman Talas (Colocasia esculenta (L.) Schott). Ilmu Pertanian, Vol. 10 No. 2, 2003: 17-25.
Hendriyani, Ika Susanti dan Setiari, Nintya. 2009. Kandungan Klorofil dan Pertumbuhan Kacang Panjang (Vigna sinensis) pada Tingkat Penyediaan Air yang Berbeda. J. Sains & Mat. Vol 17 No. 3, Juli 2009: 145-150.
Hidema J, Makino A, Kurita Y, Mae T, Ohjima K. 1992. Changes in the Level of Chlorophyll and Light-harvesting Chlorophyll a/b Protein PS II in Rice Leaves Agent Under Different Irradiances from Full Expansion Through Senescense. Plant Cell Physiol 33(8): 1209-1214.
Lakitan. 2007. Dasar-Dasar Fisiologi Tumbuhan. Jakarta: PT. Raja Grafindo Persada.
Noggle, Ray, R dan Fritzs, J. George. 1979. Introductor Plant Physiology. New Delhi: Mall of India Private Ilmited.
Pratama, Tomi Anugrah. 2009. Fotosintesis. (online). (http://thetom022.files.wordpress.com/2009/06/fotosintesis.pdf., diakses tanggal 10 juli 2014).
Salisbury, Frank B. dan Ross, Cleon W. 1995. Fisiologi Tumbuhan. Bandung: Penerbit ITB.
Santoso. 2004. Fisiologi Tumbuhan. Bengkulu: Universitas Muhammadiyah Bengkulu.
Subandi, Aan. 2008. Metabolisme. (online). (http://metabolisme.blogspot.com/2007/09, diakses tanggal 10 juli 2014).
Suyitno. 2006. Penuntun Praktikum Fisiologi Tumbuhan Lanjut. Yogyakarta: UNY.
Taiz L and Zeiger E. 1991. Plant Physiology. Tokyo: The Benyamin/Cumming Publishing Company Inc.