201103_guias_bioqca_1-2011

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201103_guia s_bioqc a _1-2011 - slide pdf.c om

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA GUIA COMPONENTE PRÁCTICO DEL CURSO: 201103 – BIOQUÍMICA

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA

GUÍA COMPONENTE PRÁCTICO

201103 – BIOQUÍMICA GOLDA MEYER TORRES VARGAS (Director Nacional)

ALBERTO GARCÍA JEREZ Acreditador

DUITAMA ENERO 2011

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http://slide pdf.c om/re a de r/full/201103guia sbioqc a 1-2011

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2. ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

El presente material en primera instancia fue diseñado por el Ingeniero Rubén Darío Munera en el 2008, quien en ese entonces era el director de curso, era y es tutor de la UNAD Cead Palmira. El ingeniero Rubén Munera recopilo además las guías de laboratorio que están contenidas en el material impreso de la Unisur “Bioquímica” de Gerardo Pérez y Yolanda Navarro publicado en 1992.

Este material ha tenido tres actualizaciones, la primera en el 2008 el Ingeniero Rubén Darío Munera, la segunda en el 2009 r y la tercera en agosto de 2010 por Q.A de alimentos Golda Meyer Torres, tutor de la UNAD del Cead de Duitama, y quien se desempeña actualmente como directora del curso.

El proceso de revisión de estilo del material y aportes disciplinares, didácticos y pedagógicos en el proceso de acreditación de material didáctico desarrollado en el mes de JULIO de 2009, ENERO y AGOSTO de 2010 se hizo por parte del Biólogo Alberto García, tutor del Cead de Bucaramanga y se mantiene la vigencia para el 2011.

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3. INDICE DE CONTENIDO INTRODUCCIÓN

7

JUSTIFICACIÓN PRÁCTICA No. 1: METODOS CUALITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE AMINOÁCIDOS Y PROTEINAS

7 11

PRÁCTICA No. 2: FRACCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS EN SEMILLAS DE LEGUMINOSAS Y CEREALES POR SOLUBILIDAD

22

PRÁCTICA No. 3: ENSAYOS ENZIMATICOS CUALITATIVOS

33

PRÁCTICA No. 4 :ESTUDIO CINÉTICO DE LA UREASA

48

PRÁCTICA No. 5: DETERMINACIÓN DE VITAMINA C

64

PRÁCTICA No. 6: AISLAMIENTO DEL ARN EN LEVADURA

71

PRÁCTICA No. 7: AISLAMIENTO Y DETERMINACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS

76

PRÁCTICA No. 8- PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS 84 PRÁCTICA No. 9- HIDRÓLISIS DE POLSACARIDOS, MÉTODO DEL REACTIVO 3,5-DINITROSALICILATO

91

PRÁCTICA No. 10: RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE CARBOHIDRATOS: RECONOCIMIENTO DEL GLUCÓGENO A PARTIR DEL ALMIDÓN.

99

PRÁCTICA No. 11- RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE LÍPIDOS

110

PRÁCTICA No. 12- FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS EN SUS PRINCIPALES CONSTITUYENTES: CARBOHIDRATOS, LÍPIDOS, PROTEÍNAS Y ÁCIDOS NUCLEICOS (Opcional, puede hacerse en lugar de las prácticas #1, 6, 7, 8,10 y 11.

119

FUENTES DOCUMENTALES ANEXOS

143

SEGURIDAD INSUTRIAL

144

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

147

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4. LISTADO DE TABLAS Tabla 1: reactivos práctica 1……………………………………………………………14 Tabla 2: Marcha de la práctica 1……………………………………………………….19 Tabla 3: Rúbrica de la práctica 1………………………………………………………21 Tabla 4: reactivos práctica 2……………………………………………………………24 Tabla 5: batería de tubos método Biuret para la cuantificación de proteínas…...28 Tabla 6: batería de tubos método Folin Lowry cuantificación de proteínas……...29 Tabla 7: Rúbrica de la práctica 2……………………………………………………...31 Tabla 8: reactivos práctica 3……………………………………………………………35 Tabla 9: Marcha de la práctica 3……………………………………………………….37 Tabla 10: Marcha de la práctica 3 alfa- amilasa………………………………..........40 Tabla 11: batería de tubos efecto de la concentración, alfa-amilasa……………...42 Tabla 12: batería de tubos efecto del pH, alfa-amilasa……………………………..43 Tabla 13: batería de tubos efecto de la temperatura, alfa-amilasa………………..44 Tabla 14: Rúbrica de la práctica 3…………………………………………………….46 Tabla 15: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa tubos blanco………………...52 Tabla 16: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa, tubos problema…………….53 Tabla 17: resultados pH óptimos de la ureasa, tubos problema……………….......53 Tabla 18: resultados pH óptimos de la ureasa, método espectrofotométrico…….54 Tabla 19: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa tubos blanco método 2…….56 Tabla 20: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa tubos problema método 2…56 Tabla 21: expresión de resultados pH de la ureasa tubos problema método 2…..57 Tabla 22: baterías de tubos variación concentración de sustrato, tubos problema58 Tabla 23: expresión de resultados variación concentración de sustrato…………..58 4


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Tabla 24: baterías de tubos variación de la temperatura……………………………60 Tabla 25: baterías de tubos extracción de ureasa de leguminosas……………….61 Tabla 26: Rúbrica de la práctica 4…………………………………………………….61 Tabla 27: reactivos práctica 5…………………………………………………………..66 Tabla 28: baterías de tubos cuantificación de vitamina C…………………………..68 Tabla 29: Rúbrica de la práctica 5…………………………………………………….69 Tabla 30: reactivos práctica 6…………………………………………………………..73 Tabla 31: Rúbrica de la práctica 6…………………………………………………….74 Tabla 32: reactivos la práctica 7………………………………………………………78 Tabla 33: Rúbrica de la práctica 7…………………………………………………….81 Tabla 34: reactivos práctica 8…………………………………………………………..86 Tabla 35: Rúbrica de la práctica 8…………………………………………………….89 Tabla 36: reactivos de la práctica 9…………………………………………………..93 Tabla 37: baterías de tubos cuantificación de glucosa DNS hidrólisis química…..95 Tabla 38: baterías de tubos cuantificación de glucosa DNS hidrólisis enzimática.96 Tabla 39: Rúbrica de la práctica 9…………………………………………………….97 Tabla 40: reactivos de la práctica 10……………………………………………….101 Tabla 41: Marcha de la práctica extracción de glicógeno…………………………103 Tabla 42: Marcha de la práctica extracción de disacáridasas……………………105 Tabla 43: Marcha de la práctica acción de disacáridasas…………………………106 Tabla 44: Rubrica práctica 10………………………………………………………..108 Tabla 45: Reactivos práctica 11…………………………………………………….112 Tabla 46: Rúbrica de la práctica 12…………………………………………………117 Tabla 47: reactivos práctica 12………………………………………………………128 Tabla 48: Rúbrica de la práctica 12…………………………………………………140 5


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4.1 LISTADO DE GRÁFICOS Y FIGURAS

Figura 1: fraccionamiento de proteínas en semillas de leguminosas y cereales por solubilidad……………………………………………………………………………… 27 Figura 2: Extracción de biomoléculas……………………………………………….132 Figura 3: Extracción de lípidos de la tema de huevo……………………………..135 Figura 4: Montaje para destilación en el método de Micro Kjeldahl……………..138

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5. CARACTERÍSTICAS GENERALES Introducción

Uno de los cursos fundamentales es la Bioquímica el cual permit comprender los mecanismos de formación y transformación de los nutriente que componen un determinado alimento.

La presente guía de prácticas de laboratorio contiene una serie d experimentos básicos que complementan los conceptos fundamentales.

El trabajo de laboratorio utiliza como materiales de experimentación, materia primas de uso común como harinas de cereales y leguminosas, féculas frutas y verduras, tejidos de origen animal, que ayudan al estudiante asimilar las técnicas de uso común en la investigación bioquímica co fuentes alimenticias o potencialmente alimenticias.

La investigaciónEsnoimportante es completa se divulganaprenda los resultados e la experiencia. quesino el estudiante la formaobtenidos de reporta sus datos y a saber interpretar las conclusiones obtenidas por otro investigadores, con el fin de evaluar su propia investigación. Esto hac necesario que elabore un informe donde presente sus datos, resultados conclusiones obtenidos durante el trabajo experimental.

En esta guía de prácticas de laboratorio, se presentan 12 sesiones. Para porcentaje dentro del 100% del curso equivalen al 30%, de las cuales la prácticas del 1 a la 11 tienen una ponderación de acuerdo a la complejida

de la guía. La práctica #12, no esta considerada dentro de esta ponderación (30% porque se recomienda que esta práctica puede reemplazar de algun manera las prácticas #1, 6, 7, 8,10 y 11, que bien disponiendo de lo recursos de cada Cead, pueden ponderarla a libertad del tutor que oriente laboratorio.

Justificación

Un curso de bioquímica sin experiencia práctica es un curso incompleto, só con el desarrollo de laboratorios, los estudiantes asimilan los complejo conceptos que encierra una bioquímica general.

EL desarrollo de los laboratorios, conlleva a los estudiantes adqui competencias académicas al argumentar en los análisis de resultados, interpretar los resultados y a proponer aplicación de dichas experiencias e los contextos regionales.

Intencionalidades

PROPÓSITOS 7


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formativas

Reconocer mediante el uso de reacciones coloreadas y cualitativas presencia de aminoácidos, proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos lípidos, como constituyentes de las biomoléculas.

Cuantificar fracciones proteicas y glúcidos mediante las técnicas de anális instrumental, volumétrico y gravimétrico.

Interpretar los resultados obtenidos en cada observación para argumentar lo resultados en el análisis de resultados y proponer posibles aplicaciones e los contextos regionales.

Reconocer a las biomoléculas como unidades fundamentales y s importancia en los diferentes procesos metabólicos

Complementar con cada práctica los conceptos fundamentales de las 4 lecciones del módulo. OBJETIVOS

Que el estudiante reconozca mediante el uso de reacciones coloreadas cualitativas la presencia de aminoácidos, proteínas, carbohidratos, ácido nucleicos y lípidos, como constituyentes de las biomoléculas.

Que el estudiante cuantifique fracciones proteicas y glúcidos mediante la técnicas de análisis instrumental, volumétrico y gravimétrico.

Que estudiante los interprete los resultados obtenidos en cada observació para elargumentar resultados en el análisis de resultados y propone posibles aplicaciones en los contextos regionales.

Que el estudiante reconozca a las biomoléculas como unidade fundamentales y su importancia en los diferentes procesos metabólicos

Que el estudiante complemente con cada práctica los concepto fundamentales de las 45 lecciones del módulo.

COMPETENCIAS

El estudiante reconoce mediante el uso de reacciones coloreadas cualitativas la presencia de aminoácidos, proteínas, carbohidratos, ácido nucleicos y lípidos, como constituyentes de las biomoléculas.

El estudiante cuantifica fracciones proteicas y glúcidos mediante las técnica de análisis instrumental, volumétrico y gravimétrico. 8


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El estudiante interpreta los resultados obtenidos en cada observación pa argumentar los resultados en el análisis de resultados y proponer posible aplicaciones en los contextos regionales. El estudiante reconoce las biomoléculas como unidades fundamentales su importancia en los diferentes procesos metabólicos.

METAS

El estudiante presentará y sustentará un informe personal (pre informe) y u trabajo grupal (informe de laboratorio) como resultado del estudio, aplicació y análisis sistemático del desarrollo de cada práctica de laboratori presentando un análisis de resultados utilizando un lenguaje ampl relacionado con la temática.

El estudiante describirá a las diferentes biomoléculas identificadas en la pruebas cualitativas cuantitativas.

El estudiante resolverá los cuestionarios planteados en cada una de la prácticas de laboratorio.

El estudiante aprenderá el manejo de las principales técnicas bioquímica generales para la identificación de biomoléculas.

Denominación de Práctica no. 1: métodos cualitativos para la identificación de aminoácidos y practicas proteinas. Práctica no. 2 – fraccionamiento de proteínas en semillas de leguminosas y cereales por solubilidad. Práctica no. 3 – ensayos enzimáticos cualitativos. Práctica no. 4 – estudio cinético de la ureasa. Práctica no. 5- determinación de vitamina C. Práctica no. 6- aislamiento del en ARN levadura. Práctica no. 7- aislamiento y determinación de ácidos nucleicos. Práctica no. 8- propiedades fisicoquímicas de los carbohidratos. Práctica no. 9- hidrólisis de polisacáridos, método del reactivo 3,5dinitrosalicilato.

Práctica no. 10- reconocimiento cualitativo de carbohidratos: reconocimiento 9


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del glucógeno a partir del almidón. Práctica no. 11- reconocimiento cualitativo de lípidos

Práctica no. 12- fraccionamiento de tejidos en sus principales constituyentes

carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos (opcional, puede hacers en lugar de las prácticas practicas #1, 6, 7, 8,10 y 11.

Número de horas 16 H

Porcentaje

30%

Curso Evaluado por proyecto

SI___

Seguridad industrial

El trabajo en el laboratorio requiere la observación de una serie de normas d de seguridad que eviten posibles accidentes debido a desconocimiento de que se está haciendo. (Ver Anexo).

NO_x_

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6. DESCRIPCIÓN DE PRÁCTICAS PRACTICA No. 1: METODOS CUALITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS Tipo de practica

Presencial X Autodirigida Otra ¿Cuál

Remota

Porcentaje de evaluación Horas de la practica Temáticas de la práctica

2,5% 1H Unidad 1: Biomoléculas, específicamente el capítulo 1, aminoácido y capítulo 2, péptidos y proteínas. Intencionalidades formativas Propósitos

Reconocer a los aminoácidos como unidades estructurales de la proteínas y su importancia en los diferentes procesos metabólicos.

Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas la presenc de aminoácidos y enlaces peptídicos en las muestras.

Establecer relaciones entre la estructura y la función de la proteinas y pérdida de esta al variar su pH y solubilida (precipitación y desnaturalización).

Objetivos

Que el estudiante reconozca los aminoácidos como unidade estructurales de las proteínas. Que el estudiante analice, mediante reacciones cualitativa coloreadas la presencia de aminoácidos y enlaces peptídicos e las muestras. Que el estudiante establezca la relación entre la estructura y función de las proteinas y pérdida de esta al variar su pH solubilidad (precipitación y desnaturalización).

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultado observados en cada prueba cualitativa y relaciona el marco teóric y los resultados para dar el respectivo análisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tien cada prueba y la estructura de aminoácidos y proteínas.

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El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a a través d la elaboración de informes escritos.

Metas Al finalizar la práctica #1:

El estudiante obtendrá su calificación del respectivo pre inform personal como resultado del estudio independiente. El estudiante resolverá los respectivos cuestionarios dados.

El estudiante presentará en forma escrita el informe del respectiv laboratorio en forma grupal en donde sobresalga el análisis d resultados. Fundamentación Teórica

El estudiante como parte de su autogestión en el desarrollo de su aprendizaje autónomo, se servi investigar antes de la práctica y a manera de pre informe los siguientes temas: 1. Capítulo 1 y 2 de la Unidad 1: Biomoléculas del módulo del curso, enfatizando en: •

Clasificación de aminoácidos

•

Enlace peptídico

•

Niveles de estructuración

•

Solubilidad de proteínas: desnaturalización por calor y pH extremos. Precipitación por metales pesados, Precipitación acídica

2. Pruebas cualitativas: enfatizar en las reacciones químicas que tienen lugar y el principio del método. 1.

Reacción de la ninhidrina

2.

Reacción xantoproteica

3.

Reacción de millón

4.

Reacción del ácido glioxílico

5.

Prueba de Pauly

6.

Prueba del Nitroprusiato

7.

Reacción de Sakaguchi 12


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8.


prueba de Biuret.

Descripción de la practica

En esta práctica mediante pruebas coloreadas, se identifica los aminoácidos que componen las proteína

de los extractos utilizados basados en las reacciones de los grupos R ó cadena lateral. Se desarrolla pruebas para analizar el comportamiento y la solubilidad de proteínas en tratamientos d precipitación y desnaturalización. Estas prácticas corresponde a los temas que se tratan en la Unidad 1: Biomoléculas, específicamente capítulo 1, aminoácidos y capítulo 2, péptidos y proteínas.

Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los programas d ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes de farmacia, desarrollo de estas prácticas, ya que profundizan y analizan la relación e importancia que guardan lo aminoácidos y la función biológica de las proteinas en los tejidos biológicos.

Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos) Material de vidrio

Material biológico y otros (estudiantes)

Reactivos

Equipos

Tubos de ensayo

Alimento de origen vegetal o Reactivo de millón animal: concentrados, proteína cárnica, hígado, huevo, etc.

Estufas ( 5)

gradillas

tapabocas

Agua destilada, Solución de CuSO4 1%

pHmetro (1)

espátulas

Libros de bioquímica

Solución NaOH 30% y 40%, Solución saturada de NaCl

Centrifuga

Pipetas 1, 5 y 10 ml

Marcador de vidrio

HNO3 concentrado, Balanza analítica Cristales de sacarosa

Mallas de asbesto

Cinta para rotular

HCl concentrado, Acido triclorácetico 10%

Papel filtro

Cuaderno de laboratorio

Solución ácido pícrico mecheros saturada, Etanol 95%

Embudos

Bata blanca

Solución de (NH4SO4) al 50%, acetona

Termómetros 120 ºC

Espectrofotómetro

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Agitador de vidrio

Marcador para vidrio

Solución de acetato de plomo 0.5 %

Erlenmeyers 100 y 250 ml

Reactivo de sakaguchi, Ácido

Vasos de precipitado 250 ml

acético glacial HSO4 concentrado, Acido acético al 30%

Vasos precipitado 500 ml

Aminoácidos: glicina, tirosina, triptófano, aminoácidos azufrados, leucina

Probeta 100 ml

Ninhidrina ( 2g/l) prepárese en fresco, Hidróxido de amonio.

Pinzas para tubos en madera

Ácido sulfanilico (10 g/l en solución de HCl 1 mol/l).

Vidrios reloj grandes

Nitrito de sodio, Carbonato de sodio

Mortero con mango

Acetato de plomo, Nitrato de mercurio.

Soporte para embudos

Nitroprusiato de sodio (20 g/l, prepárese fresco).

Pinzas para tubos de ensayo metálicas

Alfa- naftol, Agua de bromo

Vasos de precipitado de 1000 ml plástico

Ácido fosfórico, Molibdato de sodio

Vasos de

Tungsteno de sodio,

precipitado de 600 plástico

Sulfato de cobre, Nitrato de sodio Tabla 1: reactivos práctica 1.

Software a utilizar en la práctica u otro tipo de requerimiento para el desarrollo de la práctica Objeto de Aprendizaje (OA): pruebas cualitativas para determinar aminoácidos y proteínas partes 1 y 2. 14


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Ubicación: Página principal del curso, tópico Unidad 1.

Seguridad Industrial REACTIVO

PROTECCION

Ácidos inorgánicos concentrados

Gafas de seguridad, tapabocas.

RIESGO

Metodología Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica: 1. Capítulo 1 y 2 de la Unidad 1: Biomoléculas del módulo del curso.

Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para

desarrollo de la práctica #1 del curso. La metodología es la siguiente:

Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe qu contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica y tab de resultados en blanco.

Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #1 de laboratori para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación d informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor. Procedimiento: 1. Pruebas Cualitativas 1. 1 Obtención de los Extractos:

-En el caso de alimentos en polvo, coloque unos 30 gramos en un vaso de precipitado, agregue 100 ml d agua destilada, agite durante 10 minutos y filtre a través de tela limpia. Conserve el líquido (filtrado) para la pruebas de las proteínas.

-En el caso de los alimentos concentrados ó sólidos, muélala o macérelas por separado y recoja el molid en vasos de precipitado. Agregue 100 ml de agua destilada, agite durante 10 minutos y filtra a través d tela. Recoja los filtrados en vasos de precipitado o en Erlenmeyers previamente marcados. Deseche lo residuos.

-En el caso de la solución de clara de huevo: Haga un pequeño orificio en uno de los extremos del huevo 15


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vierta por él la clara en un vaso precipitado, dejando dentro la yema. Luego agregue a la clara 100 ml d agua destilada y agite con el fin de disolverla.

Marcha de la práctica: Prueba

PROCEDIMIENTO en un tubo de ensayo colocar :

VOLUMEN

Biuret

extracto problema

2 ml

NaOH al 30%

2 ml

RESULTADO

ANALISIS RESULTADO DEL

Mezclar e ir añadiendo gota a gota el sulfato cúprico al 1% (CuSO4), agitando después de cada adición, hasta la aparición de un color violeta, azul o amarillo. El color violeta indica la reacción positiva.

MILLON

XANTOPROTEICA

extracto problema

2 ml

Reactivo de millón

0.5 ml

extracto problema

2 ml

HNO3 concentrado ( observar )

1m

Mezclar bien, calentar a la baño maría y 2 ml observar. Adicionar solución de NaOH al 40% lentamente sin agitar y observar. extracto problema

LIEBERMAN Cristales de sacarosa HCl concentrado

2 ml Una pizca 5 ml

Calentar a ebullición por 5 a 7 min.

GRUPOS SH

extracto problema

1 ml

Hidróxido de sodio al 40 % (NaOH)

1ml

Acetato de Plomo al 0.5 %

1 ml

Mezclar bien, calentar a la llama por 4 min , mezclando continuamente y observar

SAKAGUCHI extracto problema

2 ml 16


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Reactivo de sakaguchi

0.5 ml

Mezcla bien y observar

REACCIÓN extracto problema DEL ÁCIDO GLIOXÍLICO Ácido acético glacial

2 ml 2 ml

HSO4 concentrado, dejar caer 2 ml lentamente por las paredes del tubo inclinado, hasta que se formen dos capas. Observe el cambio de color en la interfase. Si se forma un anillo violeta en la interfase de los dos líquidos, la reacción se considera positiva Extracto problema, ajustar pH a 7.0 1 ml Reacción de la Solución de ninhidrina, hervir a baño 5 gotas ninhidrina maría por 2 min. Observar coloración.

Prueba Pauly

de Acido sulfanílico

1 ml

Extracto problema

2 ml

Enfriar en hielo Agregar solución de NaNO2 enfriar por 3 min.

y dejar

Adicionar Na2CO3. Anotar formados.

colores 2m

Prueba del Solución de nitroprusiato de sodio nitroprusiato Mezclar con el extracto problema

0.5 ml 2 ml

Adicionar Hidróxido de amonio, deje 0. 5 ml reposar por 5 min.

Precipitación de proteínas Prueba

PROCEDIMIENTO en un tubo de ensayo colocar : extracto problema

VOLUM EN

RESULTADO

ANALISIS DEL RESULTADO

2 ml

17


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PRECIPITACION ACIDICA

ácido pícrico saturado


extracto problema

2 ml

ácido acético al 30%

0.5 ml

1 ml

Agite y observe la formación precipitado (enturbamiento)

Agite y observe la formación precipitado (enturbamiento) Solución saturada de Cloruro de sodio (NaCl)

1 ml

Mezclar bien y calentar a la llama por 1 min. se presenta un enturbamiento mas o menos intenso que persiste al enfriamiento, también puede observarse pequeños grumos en las paredes del tubo. Observe el tubo sobre un fondo oscuro.


extracto problema

2ml

ácido tricloroacetico al 10%

2 ml

Agite y observe la formación precipitado (enturbamiento)

SOLVENTES ORGANICOS

extracto problema

2ml

Etanol al 95%.

2 ml

Observe la formación de precipitado (enturbamiento)

SOLVENTES ORGANICOS

extracto problema

2ml

Acetona

2 ml

Observe la formación de precipitado (enturbamiento)

SULFATO AMONIO

DE extracto problema Solución de Sulfato de amonio al 50 %

2ml 2 ml

Mezclar bien. Dejar en reposo durante 10 min. Observe si se forma 18


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un Precipitado. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 10 min., observar. La reacción positiva se manifiesta por la formación de un precipitado, dependiendo directamente de la concentración de albúmina presente en la muestra.

DESNATURALIZACIÓN CALOR

extracto problema

2ml

POR Caliente en agua hirviendo durante 10 minutos asegurándose que la temperatura interna llegue a los 95 – 100ºC. Observe la formación de precipitado (enturbamiento).

METALES

Extracto problema

2 ml

PESADOS

Gotas del metal

5 gotas

Calentar suavemente a baño maría si no observa reacción inmediata. Tabla 2: Marcha de la práctica 1.

Cuestionarios: 1. Diga cuáles son los fundamentos químicos de las pruebas estudiadas para el reconocimiento de aminoácidos. En esta parte Ud tiene que analizar el fundamento teórico de la prueba y el resultado obtenido ( de donde se obtiene el color obtenido, que indica cada prueba?) 2. Explique con argumentos válidos el comportamiento observado de las proteinas en cada una de las pruebas de precipitación. Que indica la presencia de precipitado? 3. Determine mediante graficas el extracto que más pruebas positivas obtuvo y analice esta situación. 4. Presente los cálculos para la determinación de la concentración de proteína a partir de los datos de Absorbancia y concentración de la curva patrón.

Sistema de Evaluación Evaluación individual: •

cada estudiante debe presentar en forma escrita u oral lo solicitado en el pre informe.

•

desempeño y desenvolvimiento durante la sesión de laboratorio

Evaluación grupal: •

el grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , qu contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación d 19


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resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía.

Informe o productos a entregar Pre informe antes de la práctica e Informe de laboratorio finaliza da la práctica.

Rúbrica de evaluación

Ítem Evaluado

Asistió y participó activamente del desarrollo de la práctica

Valoración Baja

El estudiante no asistió. (Puntos = 0)

Valoración Media

El estudiante asistió pero su desempeño no fue en la habilidad del trabajo en grupo y desempeño de la práctica no fu excelente. (Puntos =3.0 )

Valoración Alta El estudiante participó de manera pertinente con la actividad durante el desarrollo del laboratorio

Máximo Puntaje

10

(Puntos = 7.0)

Entrega del debido pre informe y sustentación del mismo

No hay entrega de los productos solicitados

Hay entrega de los productos solicitados pero su contenido no es pertinente.

(Puntos = 0). (Puntos = 5.0 )

Hay entrega de los productos solicitados y contenido es pertinente.

20

(Puntos =10) Estructura del Informe( portada, introducción, objetivos, desarrollo( resultados y análisis) , conclusiones y referencias)

El informe no presenta una excelente estructura.

(Puntos = 0)

Aunque el informe presenta una estructura base, la misma carece de algunos elementos del cuerpo solicitado.

El informe presenta una excelente estructura y presentación.

5

(Puntos = 0.5 ) (Puntos =1.0)

máximo de hojas 8

Redacción y ortografía

El informe presenta deficiencias en redacción y errores ortográficos (Puntos = 0)

No hay errores de ortografía y el documento presenta una mediana articulación de las ideas y la estructura de los párrafos

La redacción es excelente, las ideas están correlacionad as, y el

5

20


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(Puntos = 0.5 )

El informe no da respuesta a los lineamientos de las prácticas de laboratorio.

Fines del informe

(Puntos = 0)

Aunque presenta resultados análisis de resultados estos no son pertinentes. Se evidencia la ausencia de análisis y deducción.

(Puntos =4)

cuerpo del texto es coherente en su totalidad (Puntos 1.0) y El informe presenta una excelente articulación entre los resultados y el análisis de resultados.

45

Se evidencia la profundidad de los análisis.

(Puntos = 8)

Referencias

Se maneja de manera inadecuada el uso de citas y referencias (Puntos = 0)

TOTAL DE PUNTOS POSIBLES

Aunque presenta referencias, estas no se articulan adecuadamente con el trabajo (Puntos = 0.5)

El manejo de citas y referencias es satisfactorio (Puntos = 1.0)

5

90

Tabla 3: Rúbrica de la práctica 1.

Nota: La puntuación anterior puede ser ponderada de acuerdo al # de sesiones en cada Cead, d acuerdo a los recursos disponibles , para lo cual dicha ponderación debe guardar relación proporcional co los ítems de la rúbrica general que se presenta,

Retroalimentación

El tutor de la práctica tendrá diez (10) días hábiles para envía o entregar la respectiva retroalimentació del informe de laboratorio siguiendo lo estipulado en la rúbrica de evaluación.

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PRACTICA No. 2 – FRACCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS EN SEMILLAS DE LEGUMINOSAS Y CEREALES POR SOLUBILIDAD 1

Tipo de practica Presencial

X Autodirigida

Remota


2.5% 2H Unidad 1: Biomoléculas, específicamente el capítulo 2, péptidos y proteínas, lección 10: Clasificación y Propiedades Fisicoquímicas.

Intencionalidades formativas

Propósitos Comprobar la teoría con la práctica en relación al comportamiento según la solubilidad de proteínas. Obtener las fracciones de albúminas, globulinas, prolaminas y glutelinas a partir de tejidos biológicos. Calcular mediante espectrofotometría, la concentración de proteinas en cada una de las fracciones anteriores.

Objetivos Que el estudiante compruebe la teoría con la práctica en relación al comportamiento según la solubilidad de proteínas. Que el estudiante obtenga las fracciones de albúminas, globulinas, prolaminas y glutelinas a partir de tejidos biológicos. Que el estudiante calcule mediante espectrofotometría, la concentración de proteinas en cada una de las fracciones anteriores.

COMPETENCIAS El estudiante describe y analiza de manera eficiente los 1

Pérez, G. Navarro, Y. (1992). Bioquímica. Santa Fe de Bogotá DC: Unisur.

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resultados del fraccionamiento de proteínas con cada uno de los solventes utilizados. El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene cada fracción de proteína y el solvente usado. El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a través de la elaboración de informes escritos.

Metas Al finalizar la práctica #2: El estudiante obtendrá su calificación del respectivo pre informe personal como resultado del estudio independiente. El estudiante resolverá los respectivos cuestionarios dados. El estudiante presentará en forma escrita el informe del respectivo laboratorio en forma grupal en donde sobresalga el análisis de resultados.

Fundamentación Teórica

El estudiante como parte de su autogestión en el desarrollo de su aprendizaje autónomo, s servirá investigar antes de la práctica y a manera de pre informe los siguientes tema enfatizando en la reacciones químicas que tienen lugar y el principio del método: 1. Solubilidad y precipitación de las proteínas 2. Clasificación de Osborne de las proteínas, por el criterio de solubilidad

3. Métodos cuantitativos para la determinación de proteínas (Biuret, Folin- Lowry, Bradford Nota: algunas de las temáticas las encuentra en el módulo del curso. Como fuentes documentales consulte: Pérez, G. (1992). Ciclo de krebs. En G. Pérez, BIOQUIMICA (pág. 163). Bogotá DC: Unisur.

Rodney, B. (1999). El ciclo del ácido cítrico. En B. Rodney, Conceptos de Bioquímica (págs. 489 494). México: International Thomson Editores S.A de C.V. 23


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Rawn, J (2005). Bioquímica. Madrid: Interamericana-McGraw_Hill.


En esta práctica mediante prueba cuantitativa, se identifica y se calcula la extracció fraccionada de los componentes proteínicos de las semillas de leguminosas y cereale utilizando para ello la diferencia de solubilidades de los diferentes tipos de proteínas. Cuantificar cada una de las fracciones obtenidas utilizando el método de Folin- Lowry ó Biuret

Se desarrolla pruebas para analizar el comportamiento y la solubilidad de proteínas e tratamientos de precipitación y desnaturalización.

Esta práctica corresponde a los temas que se tratan en la Unidad 1: Biomoléculas específicamente el capítulo 2, péptidos y proteínas, lección 10: Clasificación y Propiedade Fisicoquímicas.

Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de lo programas de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal regentes de farmacia, el desarrollo de esta práctica, ya que identifican a partir de un tejid vegetal los diferentes tipos de proteínas de acuerdo a su solubilidad y analizar a partir de ell la relación que guarda dicho comportamiento y su función biológica.


Material biológico y otros (estudiantes)

Reactivos

Equipos

Tubos de ensayo

Harinas de diferentes cereales Reactivo de folin y leguminosas: soya, arveja, trigo, etc.

Estufas ( 5)

gradillas

tapabocas

Solución de sulfato de Espectrofotómetro cobre –tartrato sódico de potasio ( 5g/l de CuSO4.5H2O en tartrato sódico potásico 10 g/l).

espátulas

Libros de bioquímica

Carbonato de sodio en NaOH 0.1 mol/l.

Centrifuga

Pipetas 1, 5 y 10 ml

Marcador de vidrio

NaCI al 1%,

Balanza analítica

Balones aforados

Cinta para rotular

Etanol al 75%, 24


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de 25 ml Vasos de precipitado de 1000 ml plástico

Cuaderno de laboratorio

NaOH 0.1 N,

Vasos de Bata blanca precipitado de 600 plástico

Solución patrón de albúmina de huevo de concentración conocida.(0.25 mg/ml).

Agitador de vidrio

Reactivo de Biuret.

Marcador para vidrio

Erlenmeyers 100 y 250 ml Vasos de precipitado 250 ml Vasos precipitado 500 ml Probeta 100 ml

Vidrios reloj grandes Tabla 4: reactivos práctica 2.

Software a utilizar en la practica

Se recomienda observar el siguiente video sobre el uso del espectrofotómetro u otro materia multimedia semejante: http://www.youtube.com/watch?v=4KU8eqcjNeQ

Seguridad Industrial No hay situaciones o eventos de peligrosidad.

Metodología Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica.

Unidad 1: Biomoléculas, específicamente el capítulo 2, péptidos y proteínas, lección 1 Clasificación y Propiedades Fisicoquímicas. Métodos cuantitativos para la determinación d 25


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proteínas (Biuret, Folin- Lowry, Bradford).

Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para desarrollo de la práctica #2 del curso.

La metodología es la siguiente: Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe qu contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica tabla de resultados en blanco.

Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #2 de laboratori para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación d informe de laboratorio.

Procedimiento:

Preparación de la muestra

Pesar 2.0 g de muestra (en cada caso será una de las harinas de: arveja, soya, fríjol, haba trigo, cebada, etc.); pasarla a un tubo de ensayo, agregar 10 ml de H2O desmineralizada, agita manualmente durante 10 minutos y centrifugar la suspensión a 2500 rpm por 3 minutos. Vacia el sobrenadante a un balón aforado de 25 ml. Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2 desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior.

Después de centrifugar, el sobrenadante de esta segunda extracción se adiciona al balón qu contiene al primer sobrenadante. Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizad hasta el enrase. Así se tiene separada la fracción de las albúminas:

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figura 1: fraccionamiento de proteínas en semillas de leguminosas y cereales por solubilidad

Sobre el residuo que queda de la separación de las albúminas, se repite ahora todo el proces anterior, pero agregando esta vez NaCl al 1%. Después de centrifugar, los sobrenadantes de l primera y segunda extracción con NaCl al 1%, se llevan a otro balón aforado de 25 ml y s completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1%. Esta es la fracción de las globulinas.

Sobre el residuo anterior se extrae en idéntica forma la fracción de las prolaminas, usando est vez alcohol etílico al 75% y una temperatura de extracción cercana a 60°C. Por último sobre el mismo residuo, con la adición de solución de NaOH 0.1 N y aplicando mismo procedimiento general, se separa la fracción de las glutelinas.

Método de Biuret :

Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo proceder a la determinación de proteínas, aplicando el método de Biuret.

La curva de calibración se hará utilizando como patrón una solución de albúmina de huevo d concentración conocida.

Para las muestras de soya, arveja y fríjol, de las fracciones de albúminas y glutelinas deber tomarse para cada una y por aparte, una alícuota de 0,5 ml y llevarse a un volumen de 5 m 27


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(dilución 1 a 10) con agua desmineralizada para las albúminas y con NaOH 0,1 N para la glutelinas. Estas diluciones se usarán como extractos problemas para dichas fracciones.

En 15 tubos de ensayo rotulados pipetear en c/u las cantidades de reactivos que se indican e el siguiente cuadro. Tubos Condiciones B

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 13 14

Sol. patrón albumina, ml

– –

0. 1

0. 3

0. 5

0. 7

0. 9

1. –– –– –– –– –– –– –– –– 2

Fracción albuminas, ml

– –– –– –– –– –– –– 0. 1. –– –– –– –– –– –– – 5 0

Fracción

– –– –– –– –– –– –– –– –– 0. 1. –– –– –– ––

globulinas, ml Fracción prolaminas, ml

– 5 0 – –– –– –– –– –– –– –– –– –– –– 0. 1. –– –– – 5 0

Fracción glutelinas, – –– –– –– –– –– –– –– –– –– –– –– –– 0. 1. ml – 5 0 H2O destilada, ml

2

1. 9

1. 7

1. 5

1. 3

1. 1

0. 8

1. 5

1. 0

1. 5

1. 0

1. 5

1. 0

1. 5

1. 0

Reactivo de Biuret en todos los tubos: 4 ml Tabla 5: batería de tubos método Biuret para la cuantificación de proteínas

Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o introducir los tubos e un baño de agua a 30°C durante 10 minutos para desarrollo del color. Leer en cada tub porcentaje de transmitancia a 540 nm usando el tubo B para ajustar el 100% de transmitancia. 2. Cálculos y resultados

Consultar tablas de conversión para pasar porcentajes de transmitancia a los correspondiente valores de absorbancia o calcúlelos utilizando la fórmula:

A = 2 - log (%T) Trazar en papel milimetrado la gráfica de calibración (absorbancia en ordenadas vs concentración (mg/mI) en abcisas) e interpolar las Absorbancias de los tubos problema proceder, teniendo en cuenta las diluciones de cada caso, a calcular los porcentajes de cad fracción proteínica.

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Deberán compararse los valores obtenidos con los que se hallen en la literatura consultada.

Método de Folín- lowry : Preparación de los reactivos:

1. Solución alcalina de carbonato de sodio (Na2CO3 20 g/l en NaOH 0.1 mol/l).Se debe preparar primero el NaOH al 0.1 M y luego el carbonato se debe disolver en este, preparar 200 ml. 2. Solución de sulfato de cobre –tartrato-sódico potásico: Preparar una solución de sulfato de cobre SO4Cu en tartrato sódico potásico 10 g/l) preparar de esta solución 300 ml. 3. El día de la práctica se debe preparar la solución salina: mezclar 50 ml de (1) y 1 ml (2). 4. El reactivo de Folin se debe diluir: en un volumen igual de agua, el mismo día que se va a utilizar. 1:1 5.Patrón de proteína: 0.25 mg/l

Procedimiento: a 1 ml de muestra agregue 5 ml de una solución alcalina (mezclar 50 ml de la solución alcalina de carbonato de sodio más 1 ml de solución de sulfato de cobre –tartrato sódico potásico). Mezcle vigorosamente y deje reposar a temperatura ambiente por 10 min o más. Agregue 0. 5 ml del reactivo de Folin en forma rápida y mezclando inmediatamente. Después de 30 minutos lea la Absorbancia a 750 nm. Utilice un blanco de reacción. REACTIVO

BLANCO

T1

T2

T3

T4

T5

1 ml

0.9 ml

08 ml

0.7ml

0.6 ml

0.5

H2O PATRON ml

---

01

0.2

0.3

0.4

0.5

PROBLEMA

------

---

---

---

---

---

SOLUCION ALCALINA ( ó Folin A+C)

5 ml en todos los tubos: agitar bien y esperar 10 minutos.

REACTIVO DE FOLIN DILUIDO 1:1

T6

M1

M2

1

----

---

--

1ml

1ml

-0 ml

0.5 ml, esperar 30 minutos en la oscuridad luego leer la absorbancia a 500 ó 750 nm.

Ó 1:2 Tabla 6: batería de tubos método Folin Lowry para la cuantificación de proteínas .

Determine la concentración de proteínas de una solución problema después de preparar una 29


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curva patrón con BSA (albúmina sérica bovina). Expresión de resultados: Complete la siguiente tabla: tubo

Absorbancia (nm= )

Concentración de proteína ( mg/ml)

T1 T2 T3 T4 T5 T6 M1 M2 Tabla 7: presentación de resultados práctica 2.

Para hallar la concentración del patrón en mg/ml, debe realizar el respectivo análisis de la concentración de la solución patrón: 0.25 mg/ml y el volumen que se toma de la solución patrón. 5. Con los valores de Absorbancia y Concentración graficar: Concentración de proteína en las abscisas (X) y Absorbancia en la ordenadas (Y).

6. Obtenga la ecuación de la recta por regresión lineal y el coeficiente de regresión. Ecuación del tipo y = m x + b. Se recomienda que el valor del coeficiente de correlación sea como mínimo de 0.995.

La ecuación encontrada, servirá para realizar los cálculos de concentración de proteína en mg/ml de M1 y M2.


•

cada estudiante debe presentar en forma escrita u oral lo solicitado en el pre informe. desempeño y desenvolvimiento durante la sesión de laboratorio

Evaluación grupal: El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía. 30


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Ítem Evaluado

Asistió y participó activamente del desarrollo de la

Valoración Baja


práctica


Estructura del Informe( portada, introducción, objetivos, desarrollo( resultados y análisis) , conclusiones y referencias)

Máximo Valoración Media

Valoración Alta Puntaje


El estudiante participó de manera pertinente con la actividad 10 durante el desarrollo del laboratorio

(Puntos = 7.0) Hay entrega de los productos solicitados y contenido es pertinente.



(Puntos = 0).

(Puntos = 5.0 )




(Puntos = 0.5 )

(Puntos =1.0)


La redacción es excelente, las ideas están correlacionadas, y 5 el cuerpo del texto es coherente en su totalidad

(Puntos = 0)

20

(Puntos =10)

5

máximo de hojas 8



31


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(Puntos = 0.5 )

El informe no da respuesta a los lineamientos de las prácticas de laboratorio. Fines del informe

(Puntos = 0)

(Puntos 1.0)

Aunque presenta El informe presenta resultados y análisis de una excelente resultados estos no son articulación entre pertinentes. Se evidencia los resultados y el la ausencia de análisis y análisis de deducción. resultados. 45

(Puntos =4)


(Puntos = 8)

Referencias





5

90


Nota: La puntuación anterior puede ser ponderada de acuerdo al # de sesiones en cada Cead, de acuerdo a los recursos disponibles, para lo cual dicha ponderación debe guardar relación proporcional con los ítems de la rúbrica general que se presenta.

Retroalimentación

El tutor de la práctica tendrá diez (10) días hábiles para envía o entregar la respectiv retroalimentación del informe de laboratorio siguiendo lo estipulado en la rúbrica d evaluación.

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PRACTICA No. 3 – ENSAYOS ENZIMATICOS CUALITATIVOS Tipo de practica Presencial Porcentaje de evaluación Horas de la practica Temáticas de la práctica Intencionalidades formativas

X Autodirigida

Remota

2.5% 1H Unidad 1: Biomoléculas, específicamente el capítulo Enzimas. Propósitos

Entender el papel de las enzimas como catalizadores de lo

diferentes procesos procesosmetabólicos. bioquímicos y su importancia en lo diferentes

Analizar, mediante reacciones cualitativas la activida enzimática de la sacarasa y alfa-amilasa.

Establecer relaciones entre la estructura y la función de la enzimas y pérdida de esta al variar al variar su temperatu óptima de trabajo.

Objetivos

Que el estudiante entienda el papel de las enzimas com catalizadores de los diferentes procesos bioquímicos y s importancia en los diferentes procesos metabólicos.

Que el estudiante analice mediante reacciones cualitativa la actividad enzimática de la sacarasa y alfa-amilasa.

Que el estudiante establezca relaciones entre la estructura la función de las enzimas y pérdida de esta al variar al varia su temperatura óptima de trabajo.

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente lo resultados observados en cada prueba cualitativa y relacion el marco teórico y los resultados para dar el respectiv análisis. 33


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El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación qu tiene la prueba para carbohidratos y la actividad enzimática

El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a travé de la elaboración de informes escritos.


El estudiante obtendrá su calificación del respectivo pr informe personal como resultado del estudio independiente. El estudiante resolverá los respectivos cuestionarios dados. El estudiante presentará en forma escrita el informe del respectivo laboratorio en forma grupal en donde sobresalga el análisis de resultados.


El estudiante como parte de su autogestión en el desarrollo de su aprendizaje autónomo, se servirá investigar antes de la práctica y a manera de pre informe los siguientes temas:

1. Capítulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomoléculas del módulo del curso. Adicionalmente realizará la siguiente investigación:

2. Qué es la sacarasa, cual es su sustrato, a qué clase de enzima pertenece, cuáles son sus productos de hidrólisis. En qué consiste la prueba de Fehling y para qué clase de carbohidratos es indicativa, Por que se usa la prueba anterior en la actividad de la sacarasa?

3. Estructura química del substrato para la alfa-amilasa., enlaces que rompe o hidroliza la αamilasa, clase de enzima que es la α- amilasa, Productos de la hidrólisis de la α- amilasa. En qué consiste la reacción de lugol el almidón?¿ que entienden por temperatura óptima de una enzima, en el cuerpo humano donde se encuentra esta la α- amilasa?, que se entiende con pH óptimo de una enzima?. 4. estructura del almidón y su mecanismo de hidrólisis: enzimas implicadas.


En esta práctica mediante pruebas coloreadas, se identifica los productos de hidrólisis de la acción de la sacarasa sobre la sacarosa, y la acción de la alfa- amilasa sobre el almidón. 34


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Inicialmente se debe eatraer la enzima sacarasa o sucrasa de la levadura mediante métodos utilizados en la separación de proteínas y determinar tanto su presencia como su actividad enzimática.

Demostrar que en la saliva existe actividad α - amilásica. Comprobar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción. Determinar el pH óptimo de la enzima α - amilasa Comprobar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. Estas prácticas corresponde a los temas que se tratan en la Unidad 1: Biomoléculas específicamente el capítulo 3, Enzimas.

Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los programas de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes de farmacia, el desarrollo de estas prácticas, ya que profundizan y analizan la relación e importancia que guardan las enzimas, las cuales son de naturaleza proteína, por lo tanto su la función biológica debe ser afectada por los mismos factores que las proteínas.

Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos) Material de vidrio Vaso de precipitado de 50 ml Vaso de precipitado de 50 ml( para el grupo 2)

Mortero con mango

Material biológico ( estudiantes)

Reactivos

Equipos

Levadura granulada comercial. (No sirve pulverizada).

300 ml Acetona

Estufa a 38ºC

Solución de saliva.

Agua destilada

Balanzas (5)

espátula

100 ml de Solución de Estufas (4) sacarosa al 5%

Vidrio reloj

Reactivo de Fehling

Mallas (4)

Vaso de precipitado de 600 ml

Hielo

Termómetros (4)


100 ml TCA al 10%

Baño termostatado a 38ºC previamente.


200 ml Solución de almidón 2%.

Papel filtro ( 5 para cada grupo)

Vaso de precipitado plástico

100 ml de KCl al 1.0% pHmetro ( 2)

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de 1000 ml Vaso de precipitado plástico de 600 ml

100 ml de solución de hielo lugol.

Agitador de vidrio

50 ml Solución ácido tartárico al 1%

Termómetro de mercurio( grupo 2)

Pipeta pasteur

50 Solución de NaOH al 0.1 N

Equipo de filtración al vacio.

Probeta de 100 ml

50 Solución de NaOH al 0.5 N

Embudos y soporte

50 ml de buffer fosfato pH 6.9-7.0

Erlenmeyers 250 ml

50 ml de ácido clorhídrico al 10%

Erlenmeyers 50 ml

100 ml de solución de glucosa al 5%

Tubos de ensayo

Reactivo de selliwanoff

gradillas

150 ml de tartárico al 1%

Pipetas 1, 5,10 ml

150 ml de NaOH 0.1

Pinzas para tubos de ensayo

M Solución de HCl al 5%, Solución de NaOH al 5% Hielo y agua caliente

Pinzas de madera para tubos de ensayo

acido

Tabla 8: reactivos práctica 3.

Software a utilizar en la practica Ninguno. Seguridad Industrial REACTIVO

PROTECCION

RIESGO

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Metodología Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica: Capítulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomoléculas del módulo del curso.

Forma de trabajo:

Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para el desarrollo de la práctica #3 del curso. La metodología es la siguiente:

Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe que contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica y tabla de resultados en blanco.

Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #3 de laboratorio para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que e desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación de informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor.

Procedimiento: 1. Experimento No. 1 Sacarasa 1.1 extracción de la enzima:

Tome 17 gramos de levadura granulada (no utilice levadura molida) en un mortero y tritúrela Una vez reducida a polvo, transfiérala a un vaso de precipitado que contenga 100 ml de agua destilada y agite durante 10 minutos. Filtre a través de tela y luego a través de papel de filtro en un embudo.

Vierta el filtrado en un vaso de precipitado y agregue 50 ml de acetona. Mezcle bien y deje la mezcla quieta durante 10 minutos. Decante parte del líquido cuidando de no perder e precipitado porque es donde esta la enzima sucrasa, colóquela en hielo para evitar la desnaturalización. Marque el recipiente como SOLUCIÓN DE ENZIMA.

1.2 marcha de la práctica: 37


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prueba

PROCEDIMIENTO

V (ml)

en un tubo de ensayo colocar :

RESULTAD O

ANALISIS DE RESULTADOS

actividad enzimática enzima hervida

Solución de enzima

3 ml

Agua destilada

3 ml

Disuelva el precipitado y lleve a ebullición a 95 ºC internamente por 10 minutos. a baño maría. Deje enfriar, adicionar sacarosa en 2 ml solución fresca. Colocar el tubo a 38ºC durante 30 minutos Realizar prueba de Fehling

prueba de En un tubo aparte colocar: Fehling Solución A de Fehling

1 ml

Solución B de Fehling

1 ml

Agua destilada

3 ml

Solución enzima hervida

3 ml

Colocar el tubo en una solución de agua hirviendo por 5- 10 minutos Observar

seliwanoff

Enzima hervida

5 ml

Reactivo de selliwanoff

5 ml

Caliente a baño Maria Observar.

actividad enzimática enzima cruda

Solución de enzima

3 ml

Agua destilada

3 ml

adicionar sacarosa

2 ml

Colocar el tubo a 38ºC durante 30

38


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minutos Realizar prueba de Fehling

prueba de En un tubo aparte colocar: Fehling

Solución A de Fehling

1 ml


1 ml

Agua destilada

3 ml

Solución enzima hervida

3 ml

Colocar el tubo en una solución de agua hirviendo por 5- 10 minutos Observar .. Repita la prueba de Fehling usando en vez de la solución de enzima cruda glucosa al 5% Observar

seliwanoff

Enzima cruda

3ml

Reactivo de seliwanoff

1 ml

Caliente a baño María y observar Repetir el procedimiento de la 3 ml prueba de selliwanoff pero en lugar de la enzima hervida colocar fructosa al 5% Observar en los dos tubos si hay l formación de un color rojo intenso indicativo de cetosas como fructosa proveniente de la Hidrólisis de la sacarosa. Tabla 9: Marcha de la práctica 3.

Cuestionario:

1. Por qué se utiliza acetona para precipitar la enzima? 2. Diga cuáles son los fundamentos químicos de las pruebas estudiadas para e reconocimiento de la hidrólisis de la sacarosa. En esta parte Ud tiene que analizar el fundamento teórico de la prueba y el resultado obtenido ( de donde se obtiene el color obtenido, que indica cada prueba? 39


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3. Qué le sucede a la sacarosa al ser tratada con la enzima sucrasa?

2. Experimento No. 2: α-amilasa

2.1 Obtención de la enzima: Se debe recolectar una muestra de saliva para obtener una solución de enzima. Para ello enjuáguese varias veces con agua de bolsa y proceda a recoger en un beaker de 50 m aproximadamente 10 ml de saliva.

Adicione a la saliva 10 ml de agua destilada y mezcle bien. Filtre la solución de saliva y rotule e erlenmeyer como SOLUCIÓN DE ENZIMA α - AMILASA, manténgala incubada a 37º - 38ºC.

2.2 Marcha de la práctica Pruebas

PROCEDIMIENTO en un tubo de ensayo colocar :

V(ml)

RESULTADO

ANALISIS DE RESULTADOS

Preparación de Alistar cuatro tubos de ensayo la solución de ( marcar del 0-4): reacción Adicionar Acido tricloroacetico 0.5 ml al 10% Aparte en un beaker de 50 ml Preparara r una solución de reacción: Solución de almidón (hervir 6.0 ml durante 2 minutos). 2.0 ml Enfriar y agregar agua destilada Cloruro de potasio incubar a 38ºC.

1.0 % e 2.0 ml

ACTIVIDAD ENZIMATICA

Solución de reacción*

10 ml

Agitar y tomar inmediatament

DE LA

solución alfa- amilasa*

6 ml

e

3 ml - AMILASA. tomar de esta solución tiempo : cinco Colocarla en el tubo 0 con minutos ácido tricloroacetico α

Gotas reactivo de lugol gota a Gotas gota hasta coloración rojiza o 40


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café.

ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA

Solución de reacción+ amilasa *( la misma cantidad de arriba)

- AMILASA. tomar de esta solución a los 10 3 ml tiempo : 10 minutos minutos Colocarla en el tubo 1 con ácido tricloroacetico α

Gotas reactivo de lugol


Gotas

Solución de reacción+ amilasa *( la misma de arriba) tomar de esta solución a los 20

3 ml

- AMILASA. minutos tiempo : 20 Colocarla en el tubo 3 con minutos ácido tricloroacetico α

Gotas reactivo de lugol gota a Gotas gota hasta coloración rojiza o 5 café.


Solución de reacción+ amilasa *( la misma de arriba)

de esta solución a los 30 3ml - AMILASA. tomar minutos tiempo : 30 Colocarla en el tubo 4 con minutos ácido tricloroacetico α

Gotas reactivo de lugol gota a Gotas gota hasta coloración rojiza o café.

Prueba Fehling

de En un tubo aparte colocar: Solución A de Fehling

1 ml


1 ml

Agua destilada

2 ml

Solución restante de reacción 3ml + amilasa*

41


41/149

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Colocar el tubo en una solución de agua hirviendo por 5- 10 minutos Observar Tabla 10: Marcha de la práctica 3 alfa- amilasa.

Cuestionario:

Explique y analice los resultados obtenidos cuando reacciona con el lugol, que resultados se obtiene? Que coloración produce los productos de la hidrólisis del almidón y cuales son? • 2.2 preparación de la solución de enzima y Efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de reacción • •

Se debe recolectar una muestra de saliva para obtener una solución de enzima. Para ello enjuáguese varias veces con agua de bolsa y proceda a recoger en un beaker de 50 m aproximadamente 10 ml de saliva.

Adicione a la saliva 10 ml de agua destilada y mezcle bien. Filtre la solución de saliva y rotule e erlenmeyer como SOLUCIÓN DE ENZIMA α - AMILASA e incube a 38ºC.

Prepare cuatro tubos de ensayo de la siguiente forma: Tubo

1

2

3

4

reactivo Cloruro potasio

de 0.2 ml

0.2 ml

0.2 ml

0.2 ml

Solución almidón

de 0.5 ml

0.5 ml

0.5 ml

0.5 ml

1.2 ml

1.1ml

1.0

0.9

Agua destilada

Tabla 11: batería de tubos efecto de la concentración, alfa-amilasa.

Adicione a cada tubo: (no se olvide agitar) Tubo

1

2

3

4

0.5ml

2 ml

3.5 ml

5 ml

reactivo enzima

42


42/149

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Coloque cada tubo a incubar a 38ºC por 20 minutos. Transcurrido 20 minutos en cada tubo de ensayo adicionar 0.2 ml de acido triclorácetico al 10% y adicione de manera inmediata a cada tubo (o hasta el 4) t gotas del reactivo de lugol.

Cuestionario:

Cuál es la relación del efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de reacción en la enzima según el experimento? Cuál es el papel del acido tricloroacetico? • 2.3 Determinación del pH óptimo de la α - amilasa salival •

Mida el pH de: Ácido tartárico al1%. Tomar pH ________ Acido clorhídrico al 10%. Tomar pH NaOH al 0.1 N Tomar pH ____ NaOH al 0.5 N Tomar pH ____

Prepare cinco tubos de ensayo así:

Tubo

1

2

3

4

5

reactivo Ácido 1.0 ml clorhídrico al 10% Ácido tartárico 1%

1.0 ml al

Buffer fosfato pH 6.9

1.0 ml

NaOH 0.1 N

1.0 ml

NaOH 0.5 N KCl Solución almidón Agua

1.0 ml 0.2 ml

0.2 ml

0.2 ml

0.2 ml

0.2 ml

de 0.5 ml

0.5 ml

0.5 ml

0.5 ml

0.5 ml

1.0 ml

1.0 ml

1.0 ml

1.0 ml

1.0 ml 43


43/149

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destilada Tabla 12: batería de tubos efecto del pH, alfa-amilasa.

Adicione a cada minuto a cada tubo: (no se olvide agitar) Tubo

1

2

3

4y5

4 ml

4 ml

4 ml

4 ml

reactivo enzima

Coloque cada tubo a incubar a 38ºC por 20 minutos. Transcurrido 20 minutos en cada tubo de ensayo colocar 0.2 ml de acido triclorácetico al 10% y adicione de manera inmediata a cada tubo (o hasta el 4) tres gotas del reactivo de lugol.

Cuestionario: • • •

•

Explique analicedel loslugol resultados obtenidos Cuál es ely papel en la reacción de acuerdo a los resultado grafique el comportamiento de la enzima frente a los cambios de pH. Escriba el valor óptimo de pH de la enzima y explique como llega Ud. A esa conclusión.

2.4 efecto de la temperatura sobre el efecto de la actividad enzimática. Prepare tres tubos de ensayo así: Tubo

1

2

3

Agua destilada

1.0 ml

1.0 ml

1.0 ml

KCL

0.2 ml

0.2 ml

0.2 ml

Solución de almidón

1.0 ml

1.0 ml

1.0 ml

reactivo

Tabla 13: batería de tubos efecto de la temperatura, alfa-amilasa.

Coloque el tubo #3 en baño con hielo por 20 minutos Coloque el tubo # 1 por 10 minutos a 90ºC Coloque el tubo # 2 a temperatura ambiente. Anote las temperaturas respectivas en cada tubo. Después de este tiempo añada a cada tubo:

44


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Tubo

1

2

3

2 ml

2 ml

2 ml

reactivo enzima

Coloque cada tubo incubar 38ºC por 20 al minutos. Transcurrido 20 minutos en cada tubotubo de ensayo añadir 0.2 mla de acidoatriclorácetico 10% y adicione de manera inmediata a cada (o hasta el 4) tres gotas del reactivo de lugol.

Cuestionario: •

•

•

Cuál es el papel de cloruro de potasio (KCL) presente en todo los experimentos al igual que el ácido tricloroacetico? de acuerdo a los resultado grafique el comportamiento de la enzima frente a los cambios de temperatura. Escriba el valor de la temperatura óptima de la enzima y explique cómo llega Ud. A esa

conclusión Experimento No. 3: Degradación Enzimática De Polisacáridos 2

1. Coloque 3.0 mL de solución de almidón y 2 gotas de saliva en tres tubos de ensayo previamente marcados A, B y C. 2. Determine el pH en cada tubo, utilizando un pHmetro o papel indicador universal Registre los resultados. 3. Agregue al tubo A 1.0 mL de ácido clorhídrico al 5%; al tubo B 1.0 mL de NaOH al 5%; y al tubo C 1.0 mL de agua. 4. Prepara un baño María con una temperatura de 37 ºC y coloque los tres tubos de ensayo durante 10 minutos.

5. Retire loslos tubos de ensayo del olor, baño temperatura, María y añada gotastres de lugol cada uno Registre cambios de color, etc.cinco En otros tubosade ensayo previamente marcados como D, E y F, adicione tres mL de almidón y dos gotas de saliva a cada uno. 6. Durante diez minutos coloque el tubo D en hielo, el tubo E en el baño María a 37 ºC y e tubo F en agua hirviendo. 7. Retire los tubos de ensayo D, E y F de las anteriores condiciones y agregue cinco gotas de lugol a cada uno. Registre todos los cambios que observe. Cuestionario: 1. ¿En qué situación se registró la mayor actividad enzimática y como la evidencia? Sistema de Evaluación Evaluación individual:

2

Munera, R: (2008). GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA. Palmira: Universidad Nacional Abierta y a Distancia.

45


45/149

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•


•


Evaluación grupal: El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor, que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía.



Máximo Ítem Evaluado


Entrega del debido pre informe y sustentación del mismo Estructura del Informe( portada, introducción, objetivos, desarrollo(

Valoración Baja

Valoración Media

Valoración Alta



El estudiante participó de manera pertinente con la actividad durante el desarrollo del laboratorio

Hay entrega de los

Hay entrega de los

productos solicitados pero su contenido no es pertinente.

productos solicitados y contenido es pertinente.

(Puntos = 5.0 )

(Puntos =10)



(Puntos = 0.5 )

(Puntos =1.0)


(Puntos = 0). El informe no presenta una excelente estructura.

(Puntos = 0)

resultados y análisis) , conclusiones y referencias)

Puntaje

10

(Puntos = 7.0)

20

5

máximo de hojas 8

46


46/149

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Fines del informe



(Puntos = 0)

Referencias


No hay errores de ortografía y el documento presenta una mediana articulación de las ideas y la estructura de los

La redacción es excelente, las ideas están correlacionadas, y el cuerpo del texto es coherente en su

párrafos (Puntos = 0.5 )

totalidad (Puntos 1.0)

Aunque presenta resultados y análisis de resultados estos no son pertinentes. Se evidencia la ausencia de análisis y deducción.

(Puntos =4)


5

El informe presenta una excelente articulación entre los resultados y el análisis de resultados. Se evidencia la profundidad de los análisis.

(Puntos = 8) El manejo de citas y referencias es satisfactorio (Puntos = 1.0)


45

5

90

Nota: La puntuación anterior puede ser ponderada de acuerdo al # de sesiones en cada Cead, de acuerdo a los recursos disponibles, para lo cual dicha ponderación debe guardar relación proporcional con los ítems de la rúbrica general que se presenta. Tabla 14 : Rúbrica de la práctica 3.

Retroalimentación El tutor de la práctica tendrá diez (10) días hábiles para envía o entregar la respectiva retroalimentación del informe de laboratorio siguiendo lo estipulado en la rúbrica de evaluación.

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47/149

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PRACTICA No. 4 – ESTUDIO CINÉTICO DE LA UREASA3 Tipo de practica Presencial Porcentaje de evaluación Horas de la practica Temáticas de la práctica Intencionalidades formativas

X Autodirigida

Remota

2.5 % 1½H Unidad 1: Biomoléculas, específicamente el capítulo Enzimas. Propósitos

Entender el papel de las enzimas como catalizadores de lo

diferentes procesos procesosmetabólicos. bioquímicos y su importancia en lo diferentes Evaluar la capacidad enzimática de la ureasa frente cambios de pH, concentración de enzima y temperatura. Comparar mediante dos métodos (espectofotometrico volumétrico), la capacidad enzimática de la ureasa frente cambios de pH.

Objetivos

Que el estudiante entienda el papel de las enzimas com catalizadores de los diferentes procesos bioquímicos y s importancia en los diferentes procesos metabólicos. Que el estudiante evalúe la capacidad enzimática de ureasa frente a cambios de pH, concentración de enzima temperatura.

Que el estudiante compare mediante dos método (espectrofotométrico y volumétrico), la capacidad enzimátic de la ureasa frente a cambios de pH, concentración d enzima y temperatura.

COMPETENCIAS

3


48


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El estudiante describe y analiza de manera eficiente lo resultados obtenidos en cada método de anális ((espectrofotométrico y volumétrico) y relaciona el marc teórico y los resultados para dar el respectivo análisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación qu tiene cada prueba y el mecanismo enzimático de la ureasa. El estudiante comunica los conocimientos adquiridos través de la elaboración de informes escritos.



Fundamentación Teórica El estudiante como parte de su autogestión en el desarrollo de su aprendizaje autónomo, s servirá investigar antes de la práctica y a manera de pre informe los siguientes temas:

1. Capítulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomoléculas del módulo del curso. Adicionalment realizará la siguiente investigación: ureasa 2. presencia de grupos SH. 3. Oxidación de los grupos SH Descripción de la practica

En esta práctica, se va a evaluar la presencia de la ureasa en leguminosas y tortas d oleaginosas midiendo su actividad biológica, mediante la hidrólisis de la urea. Se determinará s actividad, a través de dos métodos: el espectrofotométrico y por titulación con HCl

49


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Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos) 100 gramos de habas verdes (grupo 1) 100 gramos de frijoles verdes (grupo 2) 100 gramos de habichuelas verdes (grupo 3) 100 gramos de frijol de soya (grupo 4). Hojas de papel milimetrado, regla, borrado y lápiz. Buffer fosfato, a pH 5.0; 6.0; 7.2; 8.0 y 10.0

a 0.05 M

Solución de Urea 0.25 M Solución de HgCI2 1% Indicador de tashiro Solución de HCI

0.1 N

Buffer fosfato, a pH 4.0, 5.5, 7.0, 8.5,10.0 Solución de NaCl

0.1 M 50 ml de c/u

1%

Solución fenol – nitroprusiato de sodio : 4,7g fenol y 6mg de nitroprusiato de sodio en 100ml de agua desionizada Disolver 2g de NaOH en 100ml de agua desionizada y agregar 7,5ml de hipoclorito de sod comercial al 5%. Guardar en frasco ámbar. Solución de HCI

1.0 M (titulada exactamente). Mortero con mango

Agitadores de vidrio, Tubos de ensayo, gradillas, Balón aforado de 25 ml , Vasos de precipitad ,1000 ml de vidrio , Vasos de precipitado, 50 ml , 200,600., Vasos de precipitado, 200, 600,100 ml plásticos., Pipetas 1, 10 y 5 ml, Probetas 100 ml y 50 ml, Estufas con mallas, espátula espectrofotómetro, Centrifuga, Erlenmeyers de 50 y 250 , Incubadora o estufa entre 50-60º Vidrio reloj, Balanzas analíticas, Tablas de disección, Bureta de 25 ml , Pinzas y soporte par titulación

Software a utilizar en la practica Programa Excel.

Seguridad Industrial 50


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REACTIVO

PROTECCION

Ácidos inorgánicos


RIESGO

concentrados

Metodología Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica. Capítulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomoléculas del módulo del curso.

Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para el desarrollo de práctica #4 del curso. La metodología es la siguiente:

Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe qu contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica tabla de resultados en blanco.

Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #4 de laboratori para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación d informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor.

Procedimiento: Extracción de la ureasa

Pesar 5 g de muestra (en cada caso será una de las harinas de leguminosas o de las tortas d oleaginosas), pasarla a un erlenmeyer, agregar 10 ml de NaCl 1%; agitar mecánicamen durante 15 minutos y centrifugar la suspensión a 2.500 rpm por 15 minutos; transferir sobrenadante a un balón aforado de 25 ml. Al residuo agregar de nuevo otros 10 mI de NaC 1% y repetir exactamente el procedimiento anterior.

Reunir los dos sobrenadantes y completar a 25 ml con NaCI 1%. Este es el extracto qu contiene ureasa. Dejar en baño con hielo

51


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Determinación de la actividad a diferentes pH: pH óptimo de una enzima: Método 1:

Prepárese 2 series de 5 tubos: 5 servirán como blanco y 5 para determinar el efecto de pH

(Tubos p) rotulados claramente. Agregue lo indicado en el cuadro, incubándolos como se indic Terminada la incubación transfiera el contenido de cada tubo a un erlenmeyer diferent agregando a cada uno 3 gotas de indicador de tashiro; finalmente titule con HCI de normalida conocida.

Primera Serie

TUBOS BLANCO Tubo

Condiciones 1

2

3

4

5

Urea 0.25 M, ml Buffer Fosfato pH 5, ml

5 4.5

5 ––

5 ––

5 ––

5 ––

Buffer Fosfato pH 6, ml

––

4.5

––

––

––

Buffer Fosfato pH 7.2, ml

––

––

4.5

––

––


––

––

––

4.5

––


––

––

––

––

4.5

HgCl2 1%, gotas

4

4

4

4

4

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Incubar a 50 ºC durante cinco minutos agitando. Extracto de Ureasa, ml

Incubar a 50 ºC durante 25 minutos. Titular con HCl 0.1 N Volumen de HCl gastado en la titulación Tabla 15: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa tubos blanco

Segunda Serie

TUBOS PROBLEMA Tubos P

Condiciones Urea 0.25 M, ml

1p

2p

3p

4p

5p

5

5

5

5

5

52


52/149

5/11/2018





4.5

––

––

––

––


––

4.5

––

––

––


––

––

4.5

––

––


––

––

––

4.5

––


––

––

––

––

4.5

Extracto de Ureasa, ml

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

4

4

4

Incubar a 50 ºC durante 30 minutos. Titular con HCl 0.1 N HgCl2 1%, gotas

4

4

Titular con HCl 0.1N Tabla 16: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa, tubos problema

Expresión de resultados Tabular los resultados obtenidos así: Tubo número

ml de HCl gastado

Titulación corregida

Micromoles /ml de HCl gastado

1p 2p 3p 4p 5p Tabla 17: resultados pH óptimo de la ureasa, tubos problema

El valor corregido de la titulación es la diferencia entre el volumen de HCl 0.1 N gastado en blanco y el gastado en el problema (p) al mismo pH. Tubo número

Micromoles de urea hidrolizada

pH correspondiente

1p 2p 3p 4p

53


53/149

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5p Tabla 17: resultados pH óptimo de la ureasa, tubos problema

Determinación de la actividad a diferentes pH: pH óptimo de una enzima: Método 2: Extracto enzimático de material vegetal:

El extracto que contenga la ureasa se puede obtener de una serie de leguminosas, la recomendadas son: frijol, habas, habichuela y frijol soya. Pese aproximadamente 5,0 g d material vegetal a utilizar, colóquelo en un mortero y macere con 20ml de NaCl 1% previament enfriado en un baño de hielo-agua y realice la extracción por 15 minutos; luego Centrifuge po 10min a 2500 rpm.

Transfiera el sobrenadante a un balón aforado de 50ml y el residuo transfiéralo nuevamente mortero y realice una segunda extracción con 10ml de NaCl al 1% y frío, por 15 min. Centrifug a 2500 rpm por 10 min y coloque el sobrenadante en el balón aforado y complete a volumen co NaCl al 1%. Guarde el extracto enzimático refrigerado en un baño agua-hielo. Marque doce tubos de ensayo y adicione a cada uno las siguientes soluciones:

Tabla 18: resultados pH óptimos de la ureasa, método espectrofotométrico.

Mezclar bien el contenido de los tubos de ensayo y colocarlos en un baño termostatado entre 5 y 60o C por 10 min para el desarrollo del color. Dejar enfriar y leer la absorbancia a 630 nm; si absorbancia es mayor a 2.0, realizar la dilución adecuada y volver a leer.

Cuestionarios: 54


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Del método 1: exprese gráficamente en papel milimetrado, los micromoles de urea hidrolizado (en las ordenadas Y) Vs el pH en las abscisas (X). , para ello debe buscar resultados d grupo que realice dicha determinación.

Del método 2: Haga una gráfica de pH vs Absorbancia y de temperatura vs Absorbancia identifique el pH óptimo de la ureasa, para ello debe buscar resultados del grupo que realic dicha determinación. Compare los resultados del método 1 y 2 y realice su propio análisis y conclusiones. Que efecto tiene el pH sobre la actividad biológica de una enzima?

Método 3: El trabajo experimental se hará en dos sesiones consecutivas de laboratorio así: •

•

En la primera sesión se determinará el efecto del pH, concentración de sustrato, temperatu sobre la velocidad de la reacción enzimática. En la segunda sesión se determinará la presencia de ureasa en leguminosas y tortas d oleaginosas midiendo su actividad por el mismo método utilizado en la sesión anterior.

1. Primera sesión 1.1 Determinación de la actividad a diferentes pH

Prepárese 2 series de 5 tubos: 5 servirán como blanco y 5 para determinar el efecto de pH

(Tubos p) rotulados claramente. Agregue lo indicado en el cuadro, incubándolos como se indic Terminada la incubación transfiera el contenido de cada tubo a un erlenmeyer diferent agregando a cada uno 3 gotas de indicador de tashiro; finalmente titule con HCI de normalida conocida.

Primera Serie

TUBOS BLANCO Tubo

Condiciones 1

2

3

4

5

5

5

5

5

5


4.5

––

––

––

––


––

4.5

––

––

––


––

––

4.5

––

––


––

––

––

4.5

––

Urea 0.25 M, ml

55


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5/11/2018





––

––

––

––

4.5

HgCl2 1%, gotas

4

4

4

4

4

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Incubar a 50 ºC durante cinco minutos agitando. Extracto de Ureasa, ml

Incubar a 50 ºC durante 25 minutos. Titular con HCl 0.1 N Volumen de HCl gastado en la titulación Tabla 19: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa tubos blanco método 2

Segunda Serie

TUBOS PROBLEMA

1p

Tubos P 2p 3p 4p

5p

5

5

5

5

5


4.5

––

––

––

––


––

4.5

––

––

––


––

––

4.5

––

––


––

––

––

4.5

––


––

––

––

––

4.5

Extracto de Ureasa, ml

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

4

4

4

Condiciones Urea 0.25 M, ml

Incubar a 50 ºC durante 30 minutos. Titular con HCl 0.1 N HgCl2 1%, gotas

4

4

Titular con HCl 0.1N Tabla 20: baterías de tubos pH óptimo de la ureasa tubos problema método 2

1.1.1 Expresión de resultados Tabular los resultados obtenidos así: Tubo número

ml de HCl gastado

Titulación corregida

Micromoles/ml HCl gastado

de

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1p 2p 3p 4p 5p Tabla 21: expresión de resultados pH de la ureasa tubos problema método 2

El valor corregido de la titulación es la diferencia entre el volumen de HCl 0.1 N gastado en blanco y el gastado en el problema (p) al mismo pH.

Exprese gráficamente (gráfica 1 de su informe) en papel milimetrado, los micromoles de ure hidrolizados (en las ordenadas) vs el pH (en las abscisas). De acuerdo con los resultados de s gráfica, deduzca el pH óptimo, con el cual va a trabajar en las siguientes etapas. Tubo número

Micromoles de urea hidrolizada

pH correspondiente

1p 2p 3p 4p 5p

1.2 Efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de reacción enzimática En 8 tubos de ensayo marcados, pipetear en cada uno las cantidades de reactivos que continuación se indican: Tubos Condiciones B

1

2

3

4

5

6

7

Urea 0.25 M, ml

5

1.0

1.5

2.0

3.0

6.0

8.0

9.5

Buffer de fosfato pH óptimo, ml HgCl2, gotas

5 4

8.5 ––

8.0 ––

7.5 ––

6.5 ––

3.5 ––

1.5 ––

–– ––

Colocar todos los tubos en un baño maría a 50 ºC por cinco minutos y sin sacarlos agregar: Ureasa, ml

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

57


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Dejar en baño maría a 50 ºC durante 25 minutos y al final agregar: HgCl2 1%, gotas

4

4

4

4

4

4

4

4

Mezclar y sacar los tubos del baño Tabla 22: baterías de tubos variación concentración de sustrato, tubos problema

Transferir cuantitativamente el contenido de cada tubo a un erlenmeyer marcado, agregar cada uno 3 gotas de indicador, titular con el HCI (normalidad conocida) y comparar la diferentes titulaciones con el blanco.

1.2.1 Expresión de resultados :Tabular los resultados obtenidos así: Tubo número

Micromoles de urea

ml de HCl Titulación gastados corregida

Micromoles de HCl gastados

1 2 3 4 5 6 7

Titulación corregida, corresponde a: ml de HCl gastados - ml de HCl del blanco. Tubo número

Micromoles Velocidad en de urea moles/min hidrolizada

1/v

[S] moles de urea inicia/ml

1/[S]

1 2 3 4 5 6 7 Tabla 23: expresión de resultados variación concentración de sustrato

58


58/149

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En papel milimetrado y con datos de la tabla anterior construir las siguientes gráficas:

Gráfica No. 2 de su informe: En ordenadas datos de y o sea micromoles de urea hidrolizado por minuto. En abscisas datos de [S] o sea micromoles de urea iniciales/ml. Gráfica No. 3 de su informe: Siguiendo el procedimiento Lineweaver-Burk, en ordenada • datos de 1/v y en abscisas 1 / [S]. De estas dos gráficas, deducir la constante de Michaelis y la velocidad máxima para es reacción. El valor de Km (constante de Michaelis) debe expresarse en moles/litro. •

1.3 Determinación de la actividad a diferentes temperaturas

Se usarán cinco baños de agua a diferentes temperaturas y cada tubo se incubará como s indica a continuación: Tubo número

Incubar en:

1 2

baño de agua con hielo baño de agua a temperatura ambiente aproximadamente 16 °C

3

baño de agua a 37 °C

4

baño de agua a 60 °C

5

baño maría (92 °C)

Luego proceda a agregar los reactivos y a mantener las condiciones que se indican enseguida: Tubos Condiciones

B

1

2

3

4

5

Urea 0.25 M, ml

5

5

5

5

5

5

4.5

4.5

4.5

4.5

4.5

4.5

HgCl2, gotas

4

––

––

––

––

––

Temperatura de incubación, ºC

16

0

16

37

60

92

Buffer de fosfato pH óptimo, ml

Colocar cada tubo en baño de agua a la temperatura indicada por cinco minutos y sin sacarlos agregar. Solución de ureasa, ml

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

4

4

Agitar e incubar por 25 minutos a la temperatura correspondiente HgCl2 1%, gotas

––

4

4

4

Titular con HCl (normalidad conocida)

59


59/149

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Resultados, ml de HCl Tabla 24: baterías de tubos variación de la temperatura

1.4 Expresión de resultados

Con los resultados de la anterior serie de temperaturas y el obtenido a 50 °C (ver determinació de la actividad a diferentes pH, tubo No. 3p), grafique en papel milimetrado (gráfica No. 4 de s informe) los micromoles de urea hidrolizada (ordenadas) vs temperatura °C (abscisas). Expliqu el efecto de cada temperatura en la actividad de la ureasa.

2. Segunda sesión 2.1 Extracción de la ureasa

Pesar 5 g de muestra (en cada caso será una de las harinas de leguminosas o de las tortas d

oleaginosas), pasarlay acentrifugar un erlenmeyer, agregar 10 ml derpm NaClpor1%; mecánicamen durante 15 minutos la suspensión a 2.500 15 agitar minutos; transferir sobrenadante a un balón aforado de 25 ml. Al residuo agregar de nuevo otros 10 mI de NaC 1% y repetir exactamente el procedimiento anterior.

Reunir los dos sobrenadantes y completar a 25 ml con NaCI 1%. Este es el extracto qu contiene ureasa. En 5 tubos de ensayo marcados pipetear en cada uno las cantidades de reactivos como en tabla siguiente se indica.

Mezclar y sacar los tubos del baño. Transferir cuantitativamente el contenido de cada tubo a u erlenmeyer marcado, titular con el HCI (normalidad conocida) y comparar las diferente titulaciones con el blanco. Tubos Condiciones Urea 0.25 M, ml

5

5

5

5

5

Buffer de PO4 pH óptimo, ml

5

5

4.5

4

2.5

HgCl2 1%, gotas 4 –– –– –– –– Colocar todos los tubos en baño maría a 50 ºC por cinco minutos y sin sacarlos agregar: Extracto de ureasa, ml

0.5

0.5

1

1.5

3

Dejar en baño maría a 50 ºC durante 25 minutos y al final agregar:

60


60/149

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HgCl2 1%, gotas

––

4

4

4

4

Tabla 25: baterías de tubos extracción de ureasa de leguminosas

Nota: Si la actividad de la enzima es muy baja con las alícuotas utilizadas, repetir el ensay

usando extracto de ureasa contrariodesiureasa la enzima actividaduna aftaalícuota repita eldelensayo utilizando unamayor. diluciónPor delelextracto (porpresenta ejemplo: un 1 v/v).

2.2 Expresión de resultados

Determine la actividad ureásica de la leguminosa o la torta analizada, expresándola com micromoles de urea hidrolizado / ml del extracto de ureasa.

Compare la actividad ureásica de su extracto con los obtenidos por los demás grupos y con lo datos bibliográficos.

Cuestionario 1. 2. 3. 4. 5.

¿Qué tipo de inhibición enzimática se presenta con el uso de metales pesados? ¿Qué representan los valores de Vm y Km? ¿Qué entiende por metalo-enzimas? Dé ejemplos. ¿Qué sucedería si se reemplaza el HgCl2 por CaCI2? Explique su respuesta. ¿Todas las enzimas tienen CySH en su sitio activo? Especifique cuáles son los aminoácido presentes en el sitio activo de las enzimas cuyos sitios activos usted conoce. Sistema de Evaluación

Evaluación individual: •


•


Evaluación grupal: El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordad por el tutor, que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía.



Ítem Evaluado

Valoración Baja

Valoración Media

Valoración Alta

Máximo

61


61/149

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Puntaje Asistió y participó activamente del desarrollo práctica de la


El estudiante asistió pero su desempeño no fue en la habilidad del trabajo en

El estudiante participó de manera pertinente con la actividad durante el desarrollo

grupo y no desempeño de la práctica fu excelente. (Puntos =3.0 )

del laboratorio (Puntos = 7.0)





Estructura del

El informe no

Aunque el informe

El informe presenta una

Informe( portada, introducción, objetivos, desarrollo( resultados y análisis) , conclusiones y referencias)

presenta excelente una estructura.

presenta una estructura base, la misma carece de algunos elementos del cuerpo solicitado.

excelente estructura y presentación.

(Puntos = 0).

(Puntos = 0)

(Puntos = 5.0 )

10

20

(Puntos =10)

5

(Puntos =1.0)

(Puntos = 0.5 )

máximo de hojas 8


Fines del informe

El informe presenta deficiencias en

No hay errores de ortografía y el documento presenta una mediana

La redacción es excelente, las ideas están correlacionadas, y el cuerpo del texto es

redacción errores y ortográficos (Puntos = 0)

articulación la estructurade delas losideas y párrafos (Puntos = 0.5 )

coherente en su totalidad (Puntos 1.0)


Aunque presenta resultados El informe presenta una y análisis de resultados excelente articulación entre los estos no son pertinentes. resultados y el análisis de Se evidencia la ausencia de resultados. 45 análisis y deducción. Se evidencia la profundidad de (Puntos =4) los análisis.

(Puntos = 0)

Referencias

Se maneja de manera inadecuada el uso de citas y referencias

5

(Puntos = 8) Aunque presenta referencias, estas no se articulan adecuadamente con el trabajo (Puntos = 0.5)


5

62


62/149

5/11/2018




(Puntos = 0)


90

Nota: La puntuación anterior puede ser ponderada de acuerdo al # de sesiones en cada Cead, de acuerdo a los recursos disponibles, para lo cual dicha ponderación debe guardar relación proporcional con los ítems de la rúbrica general que se presenta. Tabla 26: Rúbrica de la práctica 4.

Retroalimentación


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63/149

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PRACTICA No. 5- DETERMINACIÓN DE VITAMIAN C 4 Tipo de practica Presencial Porcentaje de evaluación Horas de la practica Temáticas de la práctica


Autodirigida

Remota

2.0% 1½H Esta práctica no se deriva de ninguna de las contenidas en el curso, pero esta indirectamente relacionada con la Unidad 1, en la parte de biomoléculas. Propósitos Reconocer la presencia de vitamina C en diferentes muestras de alimentos. Cuantificar el contenido de vitamina C en las muestras analizadas y comparar su valor con datos teóricos. Establecer la importancia biológica de la vitamina C en los procesos metabólicos.

Objetivos Que el estudiante reconozca presencia de vitamina C en diferentes muestras de alimentos. Que el estudiante cuantifique el contenido de vitamina C en las muestras analizadas y comparar su valor con datos teóricos. Que el estudiante establezca la importancia biológica de la vitamina C en los procesos metabólicos.

COMPETENCIAS El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultados observados en cada prueba cualitativa 4


64


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y cuantitativa; relaciona el marco teórico y los resultados para dar el respectivo análisis. El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene cada prueba y la función biológica de la vitamina C. El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a través de la elaboración de informes escritos.

Metas Al finalizar la práctica #5: El estudiante obtendrá su calificación del respectivo pre informe personal como resultado del estudio independiente. El estudiante resolverá los respectivos cuestionarios dados. El estudiante presentará en forma escrita el informe del respectivo laboratorio en forma grupal en donde sobresalga el análisis de resultados.


El estudiante como parte de su autogestión en el desarrollo de su aprendizaje autónomo, se servirá investigar antes de la práctica y a manera de pre informe los siguientes temas: 1. estructura de la vitamina C ó ácido ascórbico. 2. Función biológica de la vitamina C. 3. estabilidad de la vitamina C.


En esta práctica, se va a evaluar la presencia cualitativa y cuantitativa de vitamina C en frutas y vegetales. La determinación cualitativa se realiza por observaciones directas y la forma cuantitativa, se realiza por el método espectrofotométrico.

Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)

65


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Material de vidrio

Material biológico

Reactivos

Equipos

naranja, Solución de almidón termómetros al 5% limón, tomate, zanahoria y durazno

gradilla

Jugo

de

Tubos de ensayo

Tabletas de Vitamina Lugol C.

Papel indicador

Pipetas de 5 y 10 ml

2-nitroanilina 0.16% Espectrofotómetro en acético – HCI

Tapones de caucho

Nitrito de sodio 0,08% en H2O

mecheros

Probetas de 100 ml

Etanol 96%

mallas

cido oxálico 0.15% y Solución de vitamina C, recién preparada (0.2 mg/mI). Tabla 27: reactivos práctica 5.

Software a utilizar en la practica Ninguno.

Seguridad Industrial No hay riegos en el desarrollo de la práctica.

Metodología Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica. Todo lo relacionado con vitaminas.

Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para el desarrollo de la práctica #5 del curso. La metodología es la siguiente:

Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe que 66


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contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica y tabla de resultados en blanco.

Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #5 de laboratorio para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que e desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación de informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor.

Procedimiento 1: forma cualitativa

1. Disuelva 0.5 g de almidón en 10.0 mL de agua. 2. En un tubo de ensayo adicione 2.0 mL de la solución de almidón y 1.0 mL de lugol Adicione media tableta de vitamina C. Registre sus observaciones. La decoloración de la mezcla es una indicación de la presencia de vitamina C; tenga en cuenta este resultado

como patrón de referencia. 3. Identifica cinco tubos de ensayo como A, B, C, D y E y coloca en cada uno de ellos 1.0 mL de la solución de almidón y 1.0 mL de lugol. Añada unas gotas de jugo de naranja al tubo A; unas gotas de jugo de limón al tubo B; 1.0 mL de jugo de tomate al tubo C; 1.0 mL de jugo de zanahoria al tubo D; y 1.0 mL de jugo de durazno al tubo E. Tape cada tubo con un tapón de caucho y agítelos. Registre sus observaciones para cada tubo.

Cuestionario:

1. Identifique cual de los alimentos empleados contiene mayor cantidad de vitamina C. 2. Consulte un método sencillo de laboratorio para identificar otras vitaminas diferentes a la C.

Procedimiento 2: forma cuantitativa Cada grupo traerá una fruta y una verdura de acuerdo con lo convenido previamente con e profesor.

Para obtener el extracto problema se procede de la siguiente manera: En el caso de las frutas cítricas se toma 1 ml de jugo, se pesa y luego se agregan 4 ml de ácido oxálico al 0,15%, se mezcla bien y se filtra, el filtrado se conserva para hacer la determinación colorimétrica.

Para otras frutas y verduras, se pesa lg que se macera en mortero lo mejor posible con 4 ml de solución de ácido oxálico al 0,15%. Después de filtrar completar el filtrado con la solución de oxálico hasta un volumen final de 5 ml. De ahí tomar 1 ml de cada extracto problema para tubos D1 (fruta) y D2 (verdura).

Si la extracción se va a hacer en licuadora, se recomienda pesar 6 g y adicionar 30 ml de ácido oxálico al 0.15%. 67


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Si el extracto exhibe coloración se recomienda adicionar una pequeña cantidad de carbón activado (aproximadamente 1 g por cada 10 mI de extracto coloreado) se agita y luego se centrifuga a 2500 rpm durante 10 minutos. La solución patrón de ácido ascórbico contiene 0.2 mg/ml y debe estar recientemente preparada.

El nitrito de sodio también debe estar fresco y debe asegurarse que la 2-nitro anilina se diazotice bien. Esto se logra cuando al mezclar esta con el nitrito se decolora la solución. Rotular 9 tubos de ensayo y adicionar los siguientes reactivos: Tubos Condiciones

B

1

2

2-nitroanilina, ml

0.1

0.1

Nitrito de sodio, ml

0.1

3

4

5

6

Fruta Verdura D1 D2

0.1

0.1 0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1 0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

Mezclar y esperar la decoloración Etanol 96%, ml

3.8

3.8

3.8

3.8 3.8

3.8

3.8

3.8

3.8

Patrón vitamina C, ml

––

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

––

––

Ácido oxálico, ml

1.0

0.9

0.8

0.6

0.4

0.2

––

––

––

Extracto problema, ml

––

––

––

––

––

––

––

1.0

1.0

Mezclar bien y dejar en reposo cinco minutos NaOH 10%, ml 1.2 1.2

1.2

1.2 1.2

1.2

1.2

1.2

1.2

Agua destilada, ml

3.8

3.8 3.8

3.8

3.8

3.8

3.8

3.8

3.8

Tabla 28: baterías de tubos cuantificación de vitamina C.

Se mezcla bien el contenido de cada tubo y se lee en el espectrofotómetro las Absorbancias correspondientes a una longitud de onda de 540 nm. Elabore la curva de calibración e interpole las Absorbancias de sus muestras.

2. Expresión de resultados

De acuerdo con los resultados calcular el contenido de vitamina C en la fruta y verdura correspondiente, expresándolo como mg/100 g de fruta o verdura o como mg/100 ml de jugo. Finalmente compararlo con el valor reportado en la bibliografía.

Cuestionario 68


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1. Compare el método que utilizó con otro método de determinación de la misma vitamina. 2. ¿Qué ocurriría si no se decolora por completo la solución de 2-nitroanilina al adicionar nitrito de sodio? 3. ¿Cuál es la función del hidróxido de sodio en la determinación de la vitamina C? 4. ¿Cómo se afectaría la determinación si la muestra ha sido tratada previamente con calor? 5. ¿Cómo se encuentra la vitamina C generalmente en los materiales vegetales? 6. Cite seis alimentos (verduras, frutas, leguminosas, tubérculos) ricos en vitamina C.



•


Evaluación grupal: El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor, que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía.



Ítem Evaluado



Máximo

Valoración Baja

Valoración Media







(Puntos = 0).


(Puntos = 5.0 )

10

(Puntos = 7.0)

20

(Puntos =10)

69


69/149

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Estructura del Informe( portada, introducción, objetivos, desarrollo( resultados y análisis)




, conclusiones y referencias)

(Puntos = 0)

(Puntos = 0.5 )

(Puntos =1.0)


No hay errores de ortografía y el documento presenta una mediana articulación de las ideas y la estructura de los párrafos (Puntos = 0.5 )

La redacción es excelente, las ideas están correlacionadas, y el cuerpo del texto es coherente en su totalidad (Puntos 1.0)

5

máximo de hojas 8


Fines del informe


Aunque presenta resultados El informe presenta una y análisis de resultados excelente articulación entre los estos no son pertinentes. resultados y el análisis de Se evidencia la ausencia de resultados. 45 análisis y deducción. Se evidencia la profundidad de (Puntos =4) los análisis.

(Puntos = 0)

Referencias

5

(Puntos = 8)

Se maneja de

Aunque presenta

El manejo de citas y

manera inadecuada el uso de citas y referencias (Puntos = 0)

referencias, estas no se articulan adecuadamente con el trabajo (Puntos = 0.5)

referencias es satisfactorio (Puntos = 1.0)


5

90



70


70/149

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PRACTICA No. 6- AISLAMIENTO DEL ARN EN LEVADURA5 Tipo de practica Porcentaje de evaluación Horas de la practica Temáticas de la práctica Intencionalidades formativas

Presencial 2.5%

Autodirigida

Remota

1H Capítulo 4 y 5 de la unidad 2: ácidos nucleicos y bioenergética.

Propósitos Extraer el ARN de los demás componentes celulares levadura.

a partir de

Analizar, los reactivos con laso cuales se separa el ARN de los demá componentes celulares Analizar la composición química del ARN

Objetivos

Que el estudiante aprenda a extraer el ARN de los demás componente celulares a partir de la levadura.

Que el estudiante analice , los reactivos con los cuales se separa el AR de los demás componentes celulares Que el estudiante analice la composición química del ARN

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultado observados en la prueba y relacionar el marco teórico y los resultados par dar el respectivo análisis. El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene prueba y la estructura del ARN. El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a través de elaboración de informes escritos.

5

Plummer, D. (1981). Bioquímica Práctica. Londres: Editorial McGraw-Hill.

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El estudiante obtendrá su calificación del respectivo pre informe person como resultado del estudio independiente. El estudiante resolverá los respectivos cuestionarios dados. El estudiante presentará en forma escrita el informe del respectivo laboratorio en forma grupal en donde sobresalga el análisis de resultados. Fundamentación Teórica

El estudiante como parte de su autogestión en el desarrollo de su aprendizaje autónomo, s servirá investigar antes de la práctica y a manera de pre informe los siguientes temas: 1. Capítulo 4 y 5 de la unidad 2: ácidos nucleicos y bioenergética del módulo del curso. Además se servirá investigar: 2. composición química del ARN 3. Tipos de ARN Descripción de la practica

En esta práctica, se va a extraer e identificar la composición química del ARN en células d levadura.

Estas prácticas corresponde a los temas que se tratan en la Capítulo 4 y 5 de la unidad 2: ácido nucleicos y bioenergética.

Es una práctica cualitativa para identificar la extracción de este tipo de sustancias. Una ve obtenido el Acido Nucleico se puede aplicar técnicas de identificación de pentosas y base nitrogenadas

Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los programa de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes d farmacia, el desarrollo de estas prácticas, ya que profundizan y analizan la relación e importanc que guardan las funciones de loa ácidos nucleicos y su relación con la conservación de l expresión genética. Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)

72


72/149

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Material de vidrio

Material biológico

gradilla

Levadura seca.

Tubos de ensayo Pipetas de 5 y 10 ml Tapones de caucho

Reactivos

Equipos

Solución de fenol

termómetros

Acetato de

Centrifuga

potasio Etanol absoluto Etanol absoluto

Probetas de 100 ml Vasos de precipitado de 250, 600 ml. Tabla 30: reactivos práctica 6.


Seguridad Industrial: No hay riegos en el desarrollo de la práctica Metodología Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica:

Capítulo 4 y 5 de la unidad 2: ácidos nucleicos y bioenergética del módulo del curso. Forma de trabajo:

Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para el desarrollo de la práctic #6 del curso.

La metodología es la siguiente: Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio prepara un pre informe que contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de marcha de la práctica y tabla de resultados en blanco.

Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #6 de laboratori para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación d informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor.

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Procedimiento: Suspenda 30 g de levadura seca en 120 ml de agua a 37ºC. Deje reposar por 1 min a esta temperatura y agregue 160 ml de solución concentrada de fenol (precaución: mu corrosivo). Agite mecánicamente la suspensión durante 30 min a Tº ambiente. Luego Centrifug en frío a 3000 g durante 15 min, para romper la emulsión.

Con una pipeta pasteur remueva cuidadosamente la capa superior acuosa y Centrifuge a 1000 g durante 5 min en una centrifuga refrigerada para separar la proteína desnaturalizada. Agregu acetato de potasio al sobrenadante hasta obtener una concentración final de 20g/L y precipite ARN añadiendo 2 volúmenes de etanol.

Enfríe la solución en hielo por 1 hora. Recoja el precipitado por centrifugación en frio a 2000 g po 5 min. Lave el ARN con una mezcla de etanol-agua (3:1) , luego con etanol y finalmente con éte deje secar al aire y pese. El contenido de ARN en la levadura es de aproximadamente 4% de s peso seco. Sistema de Evaluación



•


Evaluación grupal: El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada po el tutor, que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía.

Informe o productos a entregar Pre informe antes de la práctica e Informe de laboratorio finaliza da la práctica. Rúbrica de evaluación

Máximo Ítem Evaluado

Valoración Baja

Valoración Media






10

(Puntos = 7.0)

74


74/149

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ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA GUIA COMPONENTE PRÁCTICO DEL CURSO: 201103 – BIOQUÍMICA Hay entrega de los productos solicitados pero su contenido no es pertinente.


(Puntos = 5.0 )

(Puntos =10)



(Puntos = 0.5 )

(Puntos =1.0)

El informe presenta deficiencias en redacción y errores ortográficos

No hay errores de ortografía y el documento presenta una mediana articulación de las ideas y la estructura de los

La redacción es excelente, las ideas están correlacionadas, y el cuerpo del texto es

(Puntos = 0)

párrafos (Puntos = 0.5 )

coherente en su totalidad (Puntos 1.0)



(Puntos = 0).



(Puntos = 0)

20

5

máximo de hojas 8




El informe presenta una excelente articulación entre los resultados y el análisis de resultados.

(Puntos =4)


Fines del informe

5

45

(Puntos = 0)

(Puntos = 8)

Referencias


Aunque referencias, estas nopresenta se articulan adecuadamente con el trabajo (Puntos = 0.5)

El manejo de y referencias escitas satisfactorio (Puntos = 1.0)


5

90



75


75/149

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PRACTICA No. 7- AISLAMIENTO Y DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS6 Tipo de practica Presencial

Autodirigida

Remota


2.5% 1½H Capítulo 4 y 5 de la unidad 2: ácidos nucleicos y bioenergética.


Propósitos Reconocer la presencia de ARN y ADN en los tejidos biológicos.

Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas de ADN y ARN en los tejidos biológicos.

Establecer relaciones entre la estructura y la función de ARN y ADN en los procesos metabólicos.

Objetivos Reconocer la presencia de ARN y ADN en los tejidos biológicos.

Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas de ADN y ARN en los tejidos biológicos.

Establecer relaciones entre la estructura y la función de ARN y ADN en los procesos metabólicos.

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultados observados en cada prueba cualitativa y relaciona e marco teórico y los resultados para dar el respectivo análisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene cada prueba y la estructura de ARN y ADN.

El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a través de

6

Universitas Malacitana (2008). Prácticas de biomoléculas. Consultado en julio, 16, 2009 en http://www.biorom.uma.es/contenido/av_biomo/Guiones_Biomol.pdf.

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la elaboración de informes escritos.


El estudiante obtendrá su calificación del respectivo pre informe personal como resultado del estudio independiente. El estudiante resolverá los respectivos cuestionarios dados.

El estudiante presentará en forma escrita el informe del respectivo laboratorio en forma grupal en donde sobresalga el análisis de resultados.

Fundamentación Teórica El estudiante como parte de su autogestión en el desarrollo de su aprendizaje autónomo, servirá investigar antes de la práctica y a manera de pre informe los siguientes tema enfatizando en la reacciones químicas que tienen lugar y el principio del método: 1. Unidad didáctica 2: ácidos nucleicos y bioenergética: lecciones 16 a la 25.

2. EL estudiante puede complementar su gestión investigando en la bibliografía recomendada lo siguientes temas: - Ácidos Nucleicos: ADN y ARN. Identificación bioquímica. Descripción de la practica

Mediante esta práctica, se quiere separar el ARN ADN de los demás componentes celulares la levadura, del hígado de ternera y del tejido de una cebolla cabezona, para posterior identificaciones. Es una práctica cualitativa para identificar la extracción de este tipo sustancias. Una vez obtenido el Acido Nucleico se puede aplicar técnicas de identificación pentosas y bases nitrogenadas.

Esta práctica corresponde a los temas que se tratan en los Capítulo 4 y 5 de la unidad 2: ácid

nucleicos y bioenergética. Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los program de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes farmacia, el desarrollo de estas prácticas, ya que profundizan y analizan la relación e importan que guardan los ácidos nucleicos para en las reacciones bioquímica de los organismos vivos.

Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos) 77


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Material de vidrio

Material biológico

Reactivos

Balanza, espátula , vasos de

Levadura

Solución de fenol

precipitado de 600 y 250 ml Probeta de 100 ml, pipetas de 2 5 y 10 ml, agitadores de vidrio.

seca Hígado de ternera

Acetato de potasio

Tubos de ensayo, tubos falcon de 15 ml, ,

Cebolla cabezona fresca

Etanol absoluto

Tampón + detergente: NaCl

Detergente lavavajillas, sal, zumo de piña o papaya.

Éter etílico,

0,14 M, acetato magnésico 1,5 mM, KCl 5 mM, dodecil sulfato sódico (SDS) al 1%.

Equipos Balanza analítica

Tabla reactivos práctica 7

Termómetros

centrifuga

espectrofotómetro

alcohol de 96º muy frío

Fenol/cloroform o/isoamilico (25:24:1).

batidora

Acetato sódico 3 M pH 5,2. Tampón TrisEDTA: Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5.


Seguridad industrial REACTIVO Solución de fenol.

PROTECCION Gafas de seguridad, tapabocas.

RIESGO

Metodología

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Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica: Unidad didáctica 2: ácidos nucleicos y bioenergética: lecciones 16 a la 25. Forma de trabajo:

Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para el desarrollo de la prácti # 7 del curso. La metodología es la siguiente:

Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe q contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica y ta de resultados en blanco.

Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #7 de laborator para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que

desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación d informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor.

Procedimiento: 1. experimento 1: AISLAMIENTO DEL ARN EN LEVADURA7

Suspenda 30 g de levadura seca en 120 ml de agua a 37ºC. Deje reposar por 15 min a es temperatura y agregue 160 ml de solución concentrada de fenol (precaución: muy corrosiv

Agite mecánicamente la suspensión durante 30 min a Tº ambiente. Luego centrifugue en frío 3000 g durante 15 min, para romper la emulsión.

Con una pipeta pasteur remueva cuidadosamente la capa superior acuosa y Centrifuge a 100 g durante 5 min en una centrifuga refrigerada para separar la proteína desnaturalizada. Agreg acetato de potasio al sobrenadante hasta obtener una concentración final de 20g/L y precipite ARN añadiendo 2 volúmenes de etanol.

Enfríe la solución en hielo por 1 hora. Recoja el precipitado por centrifugación en frio a 2000 por 5 min. Lave el ARN con una mezcla de etanol-agua (3:1), luego con etanol y finalmente c

éter; de sudeje pesosecar seco.al aire y pese. El contenido de ARN en la levadura es de aproximadamente 4

2. experimento 2: AISLAMIENTO Y DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS8

7

Plummer, D. (1981). Bioquímica Práctica. Londres: Editorial McGraw-Hill.

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1. En un tubo de vidrio de fondo redondo, tomar 0,1-0,2 g de un hígado de ternera, pesarlo anotar su peso húmedo. 2. Desmenuzarlo tanto como sea posible con una varilla de vidrio y añadirle 10 veces el pe húmedo (en ml) de tampón salino más detergente. 3. Transferirlo a un tubo Falcon de 15 mL (tubo de plástico con tapón rojo). 4. Añadir el mismo volumen de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico que se haya añadido tampón salino con detergente. 5. Agitar vigorosamente.

6. Centrifugar a 3.500 rpm (en centrífuga de mesa) durante 5 minutos y separar con cuidado fase acuosa (fase superior). 7. Añadir 1/10 del volumen, de fase acuosa recuperada, de acetato sódico 3 M pH 5,2, y mezc bien. 8. Añadir, gota a gota, 2,5 volúmenes, de fase acuosa recuperada, de etanol absoluto. 9. Al añadir el etanol el DNA precipita en forma de un ovillo. Si no aparece el ovillo de DNA forma clara, incubar 5 minutos en hielo (o en el congelador de la nevera). Centrifugar a 3.500 rp 5 minutos y resuspender el precipitado de ácidos nucleicos en 2 mL de tampón Tris/EDTA pH 7 Si el ovillo se ve claramente, se puede "pescar" el DNA con la pipeta Pasteur, escurrir el exce de etanol y transferirlo a un tubo limpio que contenga 2 mL de Tris/EDTA 1 pH 7,5. •

Determinación del espectro de absorción de la disolución de los ácidos nucleicos

Preparar 3 mL de una dilución 1/10 de la solución de DNA obtenida en el paso anterior y determinar el espectro de absorción de la muestra entre 300 y 200 nm. Anotar las Absorbancias 260 y 280 nm. 3. experimento 3: EXTRACCION DEL ADN DE UNA CEBOLLA9 Corta la zona central de la cebolla en cuadrados En un vaso de agua adiciona 3 cucharaditas de detergente lavavajillas y una de sal y añade agua destilada hasta llenar el vaso. • Mezcla esta solución con los trozos de cebolla Licúa el conjunto, con la batidora, a velocidad máxima durante 30 segundos • Filtra el líquido obtenido con un filtro de café • • Llena hasta la mitad aproximadamente un vaso de cristal alto con la disolución filtrada Añade 3 cucharaditas de café de zumo de piña o papaya y mezcla bien • Añade un volumen de alcohol muy frío equivalente al del filtrado, cuidadosamente, • •

•

haciéndolo resbalar por las paredes del vaso para que forme una capa sobre el filtrado. Puedes utilizar la varilla de vidrio o una cucharilla para ayudarte. Deja reposar durante 2 ó 3 minutos hasta que se forme una zona turbia entre las dos 8

Universitas Malacitana (2008). Prácticas de biomoléculas. Consultado en julio, 16, 2009 en http://www.biorom.uma.es/contenido/av_biomo/Guiones_Biomol.pdf. 9

Tato M. (2000). Extracción del ADN de una cebolla. Consultado en julio, 16,2009 en http://centros5.pntic.mec.es/ies.victoria.kent/Rincon-C/Practica/PR-5.htm.

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capas. A continuación introduce la varilla y extrae una maraña de fibras blancas de ADN.

Cuestionarios

1. Valorar la pureza de la preparación de ácidos nucleicos obtenida y calcular su concentración y la cantidad de ácidos nucleicos por gramo de tejido. Comentar el resultado. 2. ¿Por qué las proteínas tienen un máximo de absorción a 280 nm? 3. ¿Qué tipo de detergente es el SDS, y cómo actúa frente a las membranas y proteínas? 4. ¿Por qué al extraer con fenol los ácidos nucleicos van a la fase acuosa y no al fenol? 5. Acción del lavavajillas y sal sobre la pared celular y las membranas plasmática y nuclear. 6. Acción de los zumos de piña y papaya 7. Acción del alcohol sobre el ADN Sistema de Evaluación Evaluación individual: •

•

cada estudiante debe presentar en forma escrita u oral lo solicitado en el pre informe. desempeño y desenvolvimiento durante la sesión de laboratorio

Evaluación grupal: El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía.



Ítem Evaluado

Valoración Baja

Valoración Media

El estudiante asistió pero su Asistió y participó activamente del desarrollo de la práctica


desempeño no fue en la habilidad del trabajo en grupo y desempeño de la práctica no fu excelente. (Puntos =3.0 )

Valoración Alta El estudiante participó de manera pertinente con la actividad durante el desarrollo del laboratorio

Máximo Puntaje

10

(Puntos =

81


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7.0)



(Puntos = 0).


(Puntos = 5.0 )


20

(Puntos =10) Estructura del Informe( portada, introducción,


Aunque el informe presenta una estructura base, la misma carece de algunos

El informe presenta una excelente

objetivos, resultadosdesarrollo( y análisis) , conclusiones y referencias)

(Puntos = 0)

elementos solicitado. del cuerpo

estructura y presentación.

5


máximo de hojas 8




(Puntos = 0)


La redacción es excelente, las ideas están correlacionad

(Puntos = 0.5 )

as, y el cuerpo del texto es coherente en su totalidad (Puntos 1.0)

Aunque presenta resultados y El informe análisis de resultados estos presenta una no son pertinentes. Se excelente evidencia la ausencia de articulación análisis y deducción. entre los resultados y el (Puntos =4) análisis de resultados.

5

45


82


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(Puntos = 8)

Referencias


Aunque presenta referencias, estas no se articulan adecuadamente

El manejo de citas y referencias es

(Puntos = 0)

con el trabajo (Puntos = 0.5)

satisfactorio (Puntos = 1.0)


5

90

Nota: La puntuación anterior puede ser ponderada de acuerdo al # de sesiones en cada Cead, de acuerdo a los recursos disponibles , para lo cual dicha ponderación debe guardar relación proporcional con los ítems de la rúbrica general que se presenta, Tabla 33: Rúbrica de la práctica 7.

Retroalimentación

El tutor de la práctica tendrá diez (10) días hábiles para envía o entregar la respectiva retroalimentación del informe de laboratorio siguiendo lo estipulado en la rúbrica de evaluación.

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PRACTICA No. 8- PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS 10 Tipo de practica Presencial

Autodirigida

Remota


2.5% 1H La Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosíntesis d Biomoléculas, específicamente el capítulo 7, Metabolismo d glúcidos.


Propósitos Reconocer a los monosacáridos como unidade estructurales de los polisacáridos como la celulosa, almidón glucógeno y su importancia en los diferentes proceso metabólicos.

Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas presencia de monosacáridos y la presencia del enlac glucocósidico en las muestras.

Establecer relaciones entre la estructura y la función de lo monosacáridos y polisacáridos y pérdida de esta al varia sus propiedades fisicoquímicas.

Objetivos

Que los estudiantes reconozcan los monosacáridos com unidades estructurales de los polisacáridos como la celulos almidón y glucógeno y su importancia en los diferente procesos metabólicos.

Que el estudiante analice mediante reacciones cualitativa coloreadas la presencia de monosacáridos y la presencia d enlace glucocósidico en las muestras. 10


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Que el estudiante establezca relaciones entre la estructura la función de los monosacáridos y polisacáridos y pérdid de esta al variar sus propiedades fisicoquímicas.

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente lo resultados observados en cada prueba cualitativa y relacion el marco teórico y los resultados para dar el respectiv análisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación qu tiene cada prueba y la de monosacáridos y polisacáridos. El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a través de la elaboración de informes escritos. Metas Al finalizar la práctica #8:



El estudiante como parte de su autogestión en el desarrollo de su aprendizaje autónomo, s servirá investigar antes de la práctica y a manera de pre informe los siguientes temas, : 1. estructura general de carbohidratos. 2. clasificación de carbohidratos: monosacáridos y disacáridos (enfatizando en al formación d enlace glicosídico). 3. principio y reacciones de: •

prueba de tollens

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•

prueba de Fehling

•

reacción del lugol y el almidón

•

prueba de Benedict

•

Prueba de Barfoed


En esta práctica mediante pruebas coloreadas, se identifica los monosacáridos y la identificació del comportamiento químico de los carbohidratos según sus funciones químicas (aldehídos cetonas). Esta práctica es un apoyo Metabolismo: catabolismo y

para la comprensión de los temas se tratan en la Unidad Biosíntesis de Biomoléculas, específicamente el capítulo

Metabolismo de glúcidos. Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los programa de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes d farmacia, el desarrollo de estas prácticas, ya que profundizan y analizan la relación e importanc que guardan los carbohidratos en las reacciones catabolismo y anabolismo para el aporte d energía metabólica.


Material

Reactivos

Equipos

biológico

práctica 7.

Tubos de ensayo

Trozo de pan

Solución de glucosa

Mecheros de gas

Vasos de precipitado de 250 y 600 ml

Una papa

Solución de fructosa

Estufas, termómetros.

Pipetas de 10 ml

Tabla 34: reactivos

Solución de almidón Solución de yodo o reactivo de lugol Solución diluida de HCl Alcohol etílico, reactivo de tollens, reactivo de Fehlin A y B).


No hay un software recomendado, en internet, el estudiante puede consultar videos ilustrativos d 86


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las pruebas a realizar.

Como complemento a la fundamentación teórica, se recomienda revisar el presentación de OA Presentación: Generalidades de Carbohidratos, que se encuentra en la página principal del curs en campus virtual de la Unad.

Seguridad industrial No hay situaciones o eventos de peligrosidad.

Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica: Los temas dados en la fundamentació teórica. Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para desarrollo de la práctica #8 del curso. La metodología es la siguiente:

Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe qu contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica y tab de resultados en blanco.

Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #8 de laboratori para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación d informe de laboratorio.

Producto a entregar : Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor. Procedimiento:

Parte A: solubilidad

1. Se toma 0.5 g de un azúcar en cada uno de los tubos de ensayo, debidamente rotulado Organice los tubos de ensayo en la gradilla. 2. Añada 2.0 ml. de agua a cada tubo de ensayo. Agite cada tubo de ensayo fuertemen durante un minuto y deje en reposo durante 30 segundos. Anote sus observaciones. 3. Repita los dos pasos anteriores utilizando otros tubos de ensayo, pero en vez de agu utilice 2.0 mL de alcohol etílico. Anote sus observaciones. 4. Construya un cuadro en donde cualifique cualitativamente el grado de solubilidad de la diferentes muestras. Parte B: prueba con los reactivos de Tollens y Fehling

1. Realice un montaje de baño de María y caliente a 60ºC. 2. Prepare soluciones de cada azúcar al 10%. Tome 1.0 mL de cada solución y llévela diferentes tubos de ensayo, previamente rotulados. Organice los tubos de ensayo en l 87


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gradilla. 3. Adicione 1.0 mL del reactivo de Tollens a cada tubo de ensayo. 4. Verifique que la temperatura en el baño María se sostenga a 60 ºC. Coloque dentro un vas de precipitado los diferentes tubos de ensayo y lleve este conjunto al baño María por minutos. Anote sus observaciones. 5. Repita los pasos dos, tres y cuatro, pero en lugar del reactivo de Tollens utilice 0.5 mL d reactivo A de Fehling y 0.5 ml. del reactivo B de Fehling. 6. Ahora, tome 2.0 mL de solución de sacarosa y agregue tres o cuatro gotas de solució diluida de HCL Agite y caliente suavemente por un minuto. Permita que se enfríe y lueg agregue 0.5 mL de reactivo A de Fehling y 0.5 mL de reactivo B de Fehling. Caliente en baño de María por tres minutos. Anote sus observaciones.

C: polisacáridos

1. Prepare una solución concentrada de almidón en agua. Caliente suavemente hasta que s forme engrudo. Déjela en reposo hasta que enfríe. Luego añada dos gotas de solución d

yodo o de reactivo de lugol. Anote sus observaciones. 2. Repita esta prueba utilizando reactivo de lugol en una rebanada de papa o de pan. Ano sus observaciones. Cuestionario:

1. ¿Qué resultados muestra la prueba con el reactivo de Tollens? ¿y con el reactivo d Fehling? 2. ¿Qué resultados muestra la prueba de solubilidad?



•


Evaluación grupal:

El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor, qu contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación d resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía. Informe o productos a entregar Pre informe antes de la práctica e Informe de laboratorio finaliza da la práctica.


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Ítem Evaluado


Valoración Baja


Valoración Media

Valoración Alta



Máximo Puntaje

10

(Puntos = 7.0) Hay entrega de los Entrega del debido pre informe y sustentación del mismo


(Puntos = 0).

productos solicitados pero su contenido no es pertinente.

(Puntos = 5.0 ) Estructura del Informe( portada, introducción, objetivos, desarrollo( resultados y análisis) , conclusiones y referencias)


(Puntos = 0)



20

(Puntos =10) El informe presenta una excelente estructura y presentación. 5

(Puntos = 0.5 )

(Puntos =1.0)

máximo de hojas 8


Fines del informe


El informe no da respuesta a los lineamientos de las


Aunque presenta resultados y análisis de resultados estos no son pertinentes. Se evidencia la ausencia de

La redacción es excelente, las ideas están correlacionadas, y el cuerpo del 5 texto es coherente en su totalidad (Puntos 1.0) El informe presenta una excelente articulación entre

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89


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prácticas de laboratorio. análisis y deducción.

(Puntos =4) (Puntos = 0)

los resultados y el análisis de resultados. Se evidencia la profundidad de los análisis.

(Puntos = 8)

Referencias





5

90




90


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PRACTICA No. 9- HIDRÓLISIS DE POLSACARIDOS, MÉTODO DEL REACTIVO 3,5-DINITROSALICILATO 11 Tipo de practica Presencial

X Autodirigida

Remota


2.5% 1½H Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosíntesis de Biomoléculas, específicamente el capítulo 7, Metabolismo de glúcidos.


Propósitos Comparar tres métodos de hidrólisis de polisacáridos determinando la cantidad de azúcar reductor formado mediante la reacción de la glucosa con 3,5-dinitrosalicilato de sodio. Reconocer los productos de hidrólisis de polisacáridos.

Cuantificar la concentración de glucosa residual como producto de las hidrólisis ácida, enzimática por el método 3,5-dinitrosalicilato de sodio del almidón y celulosa.

Objetivos

Que los estudiantes comparen tres métodos de hidrólisis de polisacáridos, determinando la cantidad de azúcar reductor formado mediante la reacción de la glucosa con 3,5-dinitrosalicilato de sodio.

Que los estudiantes rreconozcan los productos de hidrólisis de polisacáridos.

Que los estudiantes cuantifiquen la concentración de glucosa residual como producto de las hidrólisis ácida, enzimática por e método 3,5-dinitrosalicilato de sodio del almidón y celulosa.

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COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultados observados en cada prueba cualitativa y relaciona e marco teórico y los resultados para dar el respectivo análisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene cada prueba y los procesos de hidrólisis de polisacáridos.

El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a través de la elaboración de informes escritos.


El estudiante obtendrá su calificación del respectivo pre informe personal como resultado del estudio independiente. El estudiante resolverá los respectivos cuestionarios dados.

El estudiante presentará en forma escrita el informe del respectivo laboratorio en forma grupal en donde sobresalga el análisis de resultados.


El estudiante como parte de su autogestión en el desarrollo de su aprendizaje autónomo, s servirá investigar antes de la práctica y a manera de pre informe los siguientes tema enfatizando en la reacciones químicas que tienen lugar y el principio del método: 1. estructura y función biológica del almidón, glucógeno y celulosa. 2. método del reactivo 3,5-dinitrosalicilato para cuantificación de azúcares.


En esta de práctica compara tres mediante métodos de hidrólisisdedela polisacáridos, determinando cantidad azúcarsereductor formado la reacción glucosa con 3,5-dinitrosalicila de sodio. Esta práctica es un apoyo para la comprensión de los temas se tratan en la Unidad Metabolismo: catabolismo y Biosíntesis de Biomoléculas, específicamente el capítulo Metabolismo de glúcidos. 92


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Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de lo programas de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal regentes de farmacia, el desarrollo de estas prácticas, ya que profundizan y analizan la relació e importancia que guardan los carbohidratos en las reacciones catabolismo y anabolismo pa el aporte de básica energía Es importanteporademás que los estudiantes adquieran competencia de metabólica. cuantificar carbohidratos los métodos tradicionales como el DNS Somogy-Nelson.


Material biológico

Tubos de ensayo,

saliva

Vasos de precipitado de 1000, 600, 50 ml.

200 gramos de maizena.

Pipetas de 10 ml, probetas de 100 ml, agitadores de vidrio.

Reactivos

Equipos

Solución de almidón soluble (6 espectrofotómetro mg/ml) en buffer fosfato de sodio 0.02 M y pH 6.9 NaOH2, 4 N, HCI 4 N. NaOH 20% Balanza

Reactivo 3,5-dinitro salicilato de sodio: (disolver 5 g de ácido 3,5dinitro salicílico en 100 ml de NaOH 2N, calentar. Por separado, adicionar 150 g de tartrato de sodio y potasio a 250 ml de H 2O, calentar. Mezclar las dos soluciones y

centrifuga

completar a 500 Buffer fosfato deml) sodio 0.02 M pH 6.9 en NaCI 0.005 M. Reactivo de Lucas. (134 g de ZnCI 2 en 89 ml de HCI concentrado). Tabla 36: reactivos de la práctica 9.


No hay un software recomendado, en internet, el estudiante puede consultar videos ilustrativo de las pruebas a realizar.

Como complemento a la fundamentación teórica, se recomienda revisar el presentación de O Presentación: Generalidades de Carbohidratos, que se encuentra en la página principal d curso en campus virtual de la Unad. 93


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Seguridad industrial No hay situaciones o eventos de peligrosidad.

Metodología Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica : Los conceptos sugeridos en fundamentación teórica. Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para desarrollo de la práctica #9 del curso. La metodología es la siguiente:

Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe qu contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica

tabla de resultados en blanco. Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #9 de laboratori para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación d informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor.

Procedimiento:

El tutor en el momento de la práctica distribuirá el trabajo de tal manera que cada grupo realic una hidrólisis diferente sobre el mismo polisacárido; por ejemplo el grupo 1 efectuará hidrólis ácida sobre almidón proveniente de maizena y el grupo 2 efectuará la hidrólisis enzimátic sobre la misma muestra a fin de que puedan comparar los resultados.

La solución del polisacárido tendrá una concentración de 6 mg/ml y se preparará en Buffe fosfato de sodio 0.02 M pH = 6,9.

Todos los grupos realizarán la hidrólisis ácida de la celulosa en presencia de ZnCl2 (o reactiv de Lucas)

1.1 Hidrólisis ácida Rotular ocho tubos de ensayo y agregar en orden los siguientes reactivos: Tubos Condiciones B

0

1

2

3

4

5

6

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Solución almidón, ml

––

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

Agua destilada, ml

0.4

––

––

––

––

––

––

––

1

1

––

––

––

––

––

––

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

NaOH, 2.4 N HCl 4N, ml

Colocar los tubos 1 a 6 en un baño maría a ebullición y dejarlos en los siguientes tiempos: Tiempo de incubación, minutos

0

0

3

6

9

12

15

25

Finalizado el tiempo de incubación, sacar cada tubo y detener la hidrólisis agregando: NaOH, 2.4N, ml

––

––

1

1

1

1

1

1

Reactivo 3,5-dinitrosalicilato, ml

1

1

1

1

1

1

1

1

Introducir todos los tubos en el baño a ebullición durante cinco minutos, enfriar y agregar 7 ml de agua destilada. Agitar y medir transmitancia a 540 nm. Utilice el B para ajustar el 100% de transmitancia. Tabla 37: baterías de tubos cuantificación de glucosa DNS hidrólisis química.

1.2 Hidrólisis enzimática

Recoger 2 ml de saliva en un vaso de precipitados. Cuando esté todo listo para la hidrólis enzimática, diluya la saliva original tomando 0.3 ml de saliva y 19.7 ml de buffer de fosfato d sodio pH 6.9 en NaCI 0.005 M. Use inmediatamente la saliva diluida.

Si la velocidad de hidrólisis es muy rápida para obtener una rata lineal en los primeros minutos demasiado lenta, para observar una rata apreciable, repita el ensayo usando otra dilución d saliva. Rotular ocho tubos de ensayo y agregar los siguientes reactivos: Tubos Condiciones B

0

1

2

3

4

5

6

Solución almidón, ml

––

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

Agua destilada, ml

0.4

––

––

––

––

––

––

––

Saliva diluida, ml

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

Inmediatamente adicione la saliva a los tubos B y 0, agregue el siguiente reactivo: Reactivo 3,5-dinitrosalicilato, ml

1

1

––

––

––

––

––

––

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Agite todos los tubos y deje incubar a temperatura ambiente: Tiempo de incubación, minutos

0

0

3

6

9

12

15

25

––

1

1

1

1

1

1

Luego de terminar la incubación, agregue: Reactivo 3,5-dinitrosalicilato, ml

––

Coloque todos los tubos en un baño a ebullición durante cinco minutos, enfríe y agregue 8 ml de agua destilada. Mida la transmitancia a 540 nm y use el tubo B para ajustar el 100% de transmitancia. Tabla 38: baterías de tubos cuantificación de glucosa DNS hidrólisis enzimática.

1.3 Hidrólisis ácida de la celulosa en presencia de ZnCI 2

Colocar en una cápsula un trozo de algodón bien desmenuzado o vanos pedacitos pequeños d papel de filtro. Agregue 3 ml del reactivo de Lucas y caliente durante tres minutos, agitand energéticamente. Deje enfriar y neutralice rápidamente con NaOH al 20%. Si se forma u precipitado centrifugue a 2.500 rpm durante 10 minutos y luego pase 0.5 ml del sobrenadante un tubo, adicione 1 ml de NaOH 2,4 N y 1 ml del reactivo, 3,5-dinitro salicilato y proceda en igu forma a la utilizada en las hidrólisis anteriores. Repita el procedimiento calentando durante minutos.

1.4 Expresión de resultados La glucosa libre que queda después de la hidrólisis completa del almidón, (tubo No. 6 de hidrólisis ácida), representa el 100% de conversión del polisacárido en glucosa.

Tomando el valor de absorbancia de este tubo como el 100% de hidrólisis, calcule el porcenta de hidrólisis en los demás tubos de las diferentes hidrólisis.

Grafique el porcentaje de hidrólisis o formación de azúcar reductor vs tiempo para la hidrólis ácida y enzimática del almidón.

Compare el porcentaje de hidrólisis a los 3 minutos de cada polisacárido para la hidrólisis ácida la hidrólisis ácida en presencia de ZnCI2 e hidrólisis enzimática.

Cuestionario

1. ¿Cuáles son los productos de la hidrólisis enzimática parcial y total del almidón, d glicógeno y de la celulosa? 2. ¿Cuál es el efecto de la adición de NaCI al buffer fosfato usado para diluir la saliva? 3. Explique la diferencia estructural entre la celulosa y el almidón. ¿Cómo puede degradars enzimáticamente la celulosa? 4. ¿Qué son los compuestos llamados dextrinas y cuál es su importancia en la elaboración d alimentos? 96


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•


Evaluación grupal: el grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía.

Informe o productos a entregar Pre informe antes de la práctica e Informe de laboratorio finaliza d la práctica. Rúbrica de evaluación

Ítem Evaluado

Asistió y participó activamente desarrollo dedel la práctica

Valoración Baja


Valoración Media

Valoración Alta

El estudiante asistió pero su desempeño no fue en la

El estudiante participó de manera pertinente con

habilidad del trabajo en grupo y desempeño de la práctica no fu excelente. (Puntos =3.0 )

la actividad durante el desarrollo del laboratorio

Máximo Puntaje

10

(Puntos = 7.0)


Estructura del Informe( portada, introducción, objetivos, desarrollo( resultados y


(Puntos = 0).


(Puntos = 0)



(Puntos = 5.0 )

(Puntos =10)



20

5

97


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(Puntos = 0.5 )

análisis) , conclusiones y referencias)

(Puntos =1.0)

máximo de hojas 8 El informe presenta deficiencias en redacción y errores ortográficos (Puntos = 0)


El informe no da


Aunque presenta resultados El informe

respuesta a los ynoanálisis de resultados lineamientos de las son pertinentes. Se estos prácticas de laboratorio. evidencia la ausencia de análisis y deducción. Fines del informe

(Puntos = 0)

La redacción es excelente, las ideas están correlacionadas, y el cuerpo del 5 texto es coherente en su totalidad (Puntos 1.0)

(Puntos =4)

presenta excelenteuna articulación entre los resultados y el análisis de 45 resultados. Se evidencia la profundidad de los análisis.

(Puntos = 8)

Referencias





5

90



Retroalimentación


98


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RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE CARBOHIDRATOS: RECONOCIMIENTO DEL GLUCOGENO A PARTIR DEL ALMIDÓN. PRÁCTICA

No.

10-

Tipo de practica Porcentaje de evaluación Horas de la practica Temáticas de la práctica Intencionalidades formativas

Presencial 6%

Autodirigida

Remota

2H Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosíntesis de Biomoléculas específicamente el capítulo 7, Metabolismo de glúcidos.

Propósitos Extraer el glucógeno presente en materiales biológicos como e hígado. Reconocer cualitativamente la presencia de glucógeno en mediante su hidrólisis enzimática. Analizar, mediante reacciones hidrólisis del glucógeno extraído.

hígado

cualitativas los productos de la

Establecer relaciones entre la estructura y la función del glucógeno y las reacciones metabólicas en las cuales participa.

Objetivos Que el estudiante aprenda a extraer materiales biológicos como el hígado.

el glucógeno presente en

Que el estudiante reconozca cualitativamente la presencia de glucógeno en hígado mediante su hidrólisis enzimática. Que el estudiante analice mediante reacciones productos de la hidrólisis del glucógeno extraído.

cualitativas los

Que el estudiante relaciones la estructura y la función del glucógeno y las reacciones metabólicas en las cuales participa.

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultados observados en cada prueba cualitativa y relaciona el marco teórico y 99


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los resultados para dar el respectivo análisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tiene cada prueba y la estructura y función del glucógeno..

El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a través de la elaboración de informes escritos.


El estudiante obtendrá su calificación del respectivo pre informe personal como resultado del estudio independiente. El estudiante resolverá los respectivos cuestionarios dados. El estudiante presentará en forma escrita el informe del respectivo laboratorio en forma grupal en donde sobresalga el análisis de resultados. Fundamentación Teórica

El estudiante como parte de su autogestión en el desarrollo de su aprendizaje autónomo, s servirá investigar antes de la práctica y a manera de pre informe los siguientes temas enfatizando en la reacciones químicas que tienen lugar y el principio del método: 1. Glucógeno: a. b. c. d. e. f.

que es el glucógeno donde se encuentra el glucógeno y cuál es su función biológica cuál es la composición química del glucógeno cuáles son los productos de la hidrólisis del glucógeno vía enzimática. De qué organismos es característicos el glucógeno? En qué otros tejidos fuera del hígado se almacenan glúcidos en forma de glucógeno? g. Escriba con fórmulas la estructura química del glucógeno y el almidón. Mencione la diferencias encontradas. h. Porque se relaciona la alfa amilasa con el glucógeno. i. Porque se usa la prueba de Tollens y Fehling en el experimento? 2. Digestión intestinal de glúcidos: a. Que tipos de enzimas se encuentran en el intestino delgado de Humanos y rumiantes. 100


100/149

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b. Cuáles son los sustratos de dichas enzimas y los productos de hidrólisis c. En qué consiste la prueba de Benedict y de barfoed y porque se usan en e experimento? 3. Resumen Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosíntesis de específicamente el capítulo 7, Metabolismo de glúcidos.

Biomoléculas


En esta práctica se va a extraer glucógeno a partir del hígado, realizar reconocimiento de azucares a partir del glucógeno y extraer las enzimas intestinales que actúan en la hidrólisis digestiva de glúcidos y comprobar su actividad enzimática. Esta práctica es un apoyo Metabolismo: catabolismo y Metabolismo de glúcidos.

para la comprensión de los temas se tratan en la Unidad 3 Biosíntesis de Biomoléculas, específicamente el capítulo 7

Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de lo programas de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal regentes de farmacia, el desarrollo de esta práctica, ya que profundizan y analizan la relación importancia que guardan los carbohidratos en las reacciones catabolismo y anabolismo para e aporte de energía metabólica. En esta práctica, los estudiantes profundizan la relación que tien el glucógeno como reserva energética en las reacciones de generación de ATP. Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos) MATERIALES DE VIDRIO

MATERIALES BIOLOGICO

REACTIVOS

EQUIPOS

Vasos de precipitado 200 ml 100 g de hígado fresco de cerdo

Solución de KOH 30% 50 ml

Balanza analítica (1)

Vasos de precipitado de 1000 ml (vidrio y plástico)

Solución de tricloroacetico TCA 10%.

Incubadora

Erlenmeyers 250 ml

50 ml Solución saturada de Na2SO4

Centrifuga y tubos

Pipetas de 5 y 10 ml

Solución amortiguadora:

Estufas (1)

tampón fosfato sódico 0,02 M; NaCl 0,005 M pH Agitadores de vidrio

Reactivo de Fehling A y B.

micro pipetas

Reactivo de tollens.

Probetas 100 ml

10 ml de tolueno

Mallas

101


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Vidrio reloj

Reactivo de Benedict

espátulas

Acido acético glacial

Tubos de ensayo

hielo

gradillas

Sacarosa

Pinzas para tubos de ensayo

Lactosa Tollens Fehling A y B.

Tabla 40: reactivos de la práctica 10.


No hay un software recomendado, en internet, el estudiante puede consultar videos ilustrativos de las pruebas a realizar.

Como complemento a la fundamentación teórica, se recomienda revisar el presentación de OA Presentación: Generalidades de Carbohidratos, que se encuentra en la página principal del curso en campus virtual de la Unad.

Seguridad industrial REACTIVO

PROTECCION

Proceso de digestión con KOH al 30%


RIESGO

Metodología Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica:

Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosíntesis de Biomoléculas, específicamente el capítul 7, Metabolismo de glúcidos.

Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para e


Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe qu contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica y tabl 102


102/149

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de resultados en blanco.

Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #10 de laboratorio para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que e desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación de informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor. Sistema de Evaluación



•

desempeño y desenvolvimiento durante la sesión de laboratorio Evaluación grupal: El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía.

Procedimiento: EXTRACCION DE GLUCOGENO

OBSERVACIONES

Pese un erlenmeyer de 50 ml. Se ponen 3 ml de la solución de hidróxido potásico al 30% en un erlenmeyer de 50 ml. Se pesan 8 g de tejido (aproximadamente) y se introducen en el erlenmeyer. Se pesa este conjunto. Se calienta en un baño de agua hirviendo, agitando con cuidado para acelerar el proceso, durante 20 minutos (o hasta su digestión). Se enfría el tubo una vez acabada la digestión. Una vez enfriado el tubo de se añaden 0,2 ml de la solución saturada de Na2SO4 y se mezclan fuertemente. Reposar 5 minutos. Se precipita el glucógeno que está en solución por adición de 7 m de etanol al 95%. Se agita y deja en frío en un baño de hielo durante 5 minutos.

103


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Se pesan los tubos de centrifuga.

Primera centrifugación:

Segunda

Se pasa la solución a tubos de centrífuga se centrifuga 3000 rpm durante 5 minutos. Se desecha el sobrenadante Se añaden 5 ml de la solución de TCA al 10% al tubo y se disuelve totalmente el sedimento agitando fuertemente. Se centrifuga de nuevo.

centrifugación:

Se añade el sobrenadante a un tubo de ensayo largo, al que previamente se han añadido 10 mL de etanol al 95%, desechando el sedimento de la centrifugación. Se deja reposar 5 minutos para que se produzca la precipitación del glucógeno.

Tercera

Se traslada la solución al tubo de centrífuga previamente pesado, y se centrifuga durante 5 minutos

centrifugación:

Una vez acabada la centrifugación se tira el sobrenadante. El sedimento obtenido representa el glucógeno prácticamente exento de sustancias contaminantes. Secar en la estufa a 35°C hasta su utilización.

Cantidad de glucógeno

Se pesa en la balanza el tubo con el glucógeno desecado, obtenido en la parte anterior, y se anota el resultado.( determinar la cantidad de glucógeno obtenido).

Solución de glucógeno

De acuerdo a la cantidad de glucógeno obtenido hacer la siguiente relación: 8 mg de glucógeno por 0.5 ml de solución tampón fosfato 0,02 M pH 7,0 que contenga NaCl 0,005 M, De esta manera queda preparado el glucógeno para las siguientes determinaciones.

Hidrólisis enzimática del glucógeno por la enzima alfamailasa. Pruebas

PROCEDIMIENTO

VOLUMEN

RESULTADO

PRUEBA POSITIVA PARA:

Recolección de la alfa Recoja 20 ml de alfa amilasa salival amilasa fresca. Adición de la Tome cuatro tubos de ensayo y en alfa amilasa cada uno agregue: 104


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sobre glucógeno

el de solución de glucógeno solución de saliva

1 ml 3 ml

Incubar a 37 ºC por 45 minutos AL cabo del tiempo adicionar a caca 1 ml. tubo TCA (ácido tricloroacetico `para parar la reacción) Realice las pruebas respectivas para determinar los productos de la hidrólisis del almidón. Solución A de Fehling

1 ml

Prueba de


1 ml

FEHLING

Agua destilada

1 ml

Solución de glucógeno + enzima

2 ml

Colocar el tubo en una solución de agua hirviendo por 5- 10 minutos Reactivo de tollens

2ml

Solución de glucógeno + enzima

2 ml

Agite los tubos y déjelo un baño de

Prueba de TOLLENS

agua a 35º C, durante 5 minutos Un espejo de plata o un precipitado negro es prueba positiva indica la presencia de glucosa proveniente de la hidrólisis del glucógeno.

Tabla 41: Marcha de la práctica extracción de glicógeno.

1.2 EXTRACCION DE LAS ENZIMAS INTESTINALES Prueba

EXTRACCION DE LAS ENZIMAS INTESTINALES Observaciones ( escriba aquí sus observaciones)

Utilice intestino delgado (duodeno) de res u oveja recién sacrificada (no sirve intestinos de más de un Extracción de día, y estos deben refrigerasen (no congelar) en el las enzimas menor tiempo posible. En caso de que el Laboratorio no se realice inmediatamente se 105


105/149

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intestinales.

sacrifique el animal, extraer la primera porción del intestino delgado (duodeno) y manténgalo en el refrigerador a un tiempo no mayor de 12 horas a la práctica.

REALICE TODAS LAS OPERACIONES BAJO BAÑO DE HIELO. Utilice de 10 a 15 cm de duodeno. Córtelo a lo largo con unas tijeras provistas de buen corte, lave el intestino preferiblemente con agua destilada, córtelo en pedazos pequeñitos y en un mortero, tritúrelo, en baño de hielo Recoja el molido en un vaso de precipitado en baño de hielo y agregue 50 ml de agua destilada y 2 gotas de tolueno. Agite bien. Es aconsejable que trabaje hasta aquí lo más rápido posible. Agitar. Durante unos 15 minutos y filtre a través de una tela limpia, sobre un baño de hielo. En el líquido, que debe salir claro, están las enzimas.

SOLUCIÓN DE ENZIMA

Mantenga en hielo el tubo de enzima cruda.

Tabla 42: Marcha de la práctica extracción de de disacáridasas.

ACCION DE LAS DISACARIDASAS Pruebas

Acción enzimática

PROCEDIMIENTO

VOLUMEN

Solución de sacarosa recién preparada al 5%

5 ml

A cada tubo adicionar enzima cruda

5 ml

RESULTADO

PRUEBA POSITIVA PARA:

Incubar a 38ºC por una hora. Repetir: Solución de lactosa preparada al 5%

y maltosa recién 5 ml

A cada tubo adicionar enzima cruda

2 ml

106


106/149

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Incubar a 38ºC por una hora. Realice las pruebas respectivas para determinar los productos de la hidrólisis del la sacarosa y la lactosa respectivamente.

PRUEBA DE Reactivo de Benedict BENEDICT Solución enzimática

2m 2.0 ml

Baño maría por 5 minutos Repita el procedimiento para la siguiente solución problema. Repita la experiencia sobre soluciones de sacarosa y lactosa.

PRUEBA BARFOED DE Reactivo de BARFOED Solución enzimática

2m 2.0 ml

Baño maría por 5 minutos Repita el procedimiento para la siguiente solución problema. Para que sea positivo para monosacáridos, la coloración una vez en el baño maría no debe durar mas de 5 minutos. Después de los 5 min se consideran disacáridos.

PRUEBA FEHLING

DE

Prueba tollens

de Realice la prueba de tollens a las soluciones enzimáticas con los siguientes sustratos: lactosa, sacarosa y maltosa. De igual forma realice patrones para glucosa, sacarosa, lactosa y maltosa.

Realice la prueba de Fehling a las soluciones enzimáticas con los siguientes sustratos: lactosa, sacarosa y maltosa. De igual forma realice patrones para glucosa, sacarosa, lactosa y maltosa.

Tabla 43: Marcha de la práctica acción de disacáridasas.

Informe o productos a entregar

107


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Pre informe antes de la práctica e Informe de laboratorio finaliza da la práctica.


Ítem Evaluado


Valoración Baja


Valoración Media


Valoración Alta Máximo Puntaje El estudiante participó de manera pertinente con la actividad durante el desarrollo del laboratorio

10

(Puntos = 7.0)




(Puntos = 0).


(Puntos = 5.0 ) El informe no presenta una excelente estructura.

(Puntos = 0)



20

(Puntos =10) El informe presenta una excelente estructura y presentación. 5


máximo de hojas 8





108


108/149

5/11/2018





(Puntos = 0)


El informe presenta una excelente articulación entre los resultados y el

(Puntos =4)

análisis de resultados.

45


(Puntos = 8)

Referencias


Aunque presenta referencias, estas no se articulan adecuadamente

El manejo de citas y referencias es

(Puntos = 0)

con el trabajo (Puntos = 0.5)

satisfactorio (Puntos = 1.0)


5

90




109


109/149

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PRACTICA No. 11- RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE LIPIDOS Tipo de practica Presencial

Autodirigida

Remota


2% 2H Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosíntesis d Biomoléculas, específicamente el capítulo 8, Metabolismo d lípidos.


Propósitos

Reconocer losbiológicos. diferentes tipos de lípidos que se encuentra en los tejidos

Analizar, mediante reacciones cualitativas la presencia d algunos de los tipos de lípidos como fosfolípidos, ácido grasos, colesterol y glucolipidos en cada una de la muestras.

Establecer relaciones entre la estructura y la función de la los lípidos y su participación en los diferentes proceso metabólicos.

Objetivos

Que el estudiante reconozca los diferentes tipos de lípido que se encuentran en los tejidos biológicos.

Que el estudiante analice los resultados obtenidos en la reacciones cualitativas, la presencia de algunos de los tipo de lípidos como fosfolípidos, ácidos grasos, colesterol glucolipidos en cada una de las muestras.

Que el estudiante establezca relaciones entre la estructura la función de las los lípidos y su participación en lo diferentes procesos metabólicos.

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente lo 110


110/149

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resultados observados en cada prueba cualitativa y relacion el marco teórico y los resultados para dar el respectiv análisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación qu tiene cada prueba y la estructura y función con el tipo d lípido.

El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a travé de la elaboración de informes escritos.


El estudiante obtendrá su calificación del respectivo pr informe personal como resultado del estudio independiente. El estudiante resolverá los respectivos cuestionarios dados. El estudiante presentará en forma escrita el informe del respectivo laboratorio en forma grupal en donde sobresalga el análisis de resultados. Fundamentación Teórica

Marco teórico

El estudiante como parte de su autogestión en el desarrollo de su aprendizaje autónomo, se servirá investigar antes de la práctica y a manera de pre informe los siguientes temas enfatizando en la reacciones químicas que tienen lugar y el principio del método: 1. Qué son los lípidos compuestos, 2. quiénes integran a los lípidos compuestos, 3. Qué es el colesterol, 4. cuál es la importancia biológica del colesterol, 5. estructura del colesterol, 6. que pruebas coloreadas existen para identificar el colesterol 7. a qué tipo de lípidos pertenece el colesterol. 8. composición química de la yema de huevo. 9. que son los fosfolípidos, 10. Cuál es la estructura química de los fosfolípidos 11. cuál es la importancia biológica de los fosfolípidos. 12. Qué son los esfingolípidos 13. Cuál es la estructura de los esfingolípidos 111


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14. Qué son los glucolipidos 15. Cuál es la estructura de los glucolipidos 16. Qué son los fosfolípidos Descripción de la practica

En esta práctica se extraer y separar entre sí lípidos compuestos de la yema de huevo y reconocerlos y se reconocen mediante su composición química. También se extraen lípidos de cerebro y analizar las diferentes clases de lípidos que se encuentran en este tejido biológico. Esta práctica se relaciona con la Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biomoléculas, específicamente el capítulo 8, Metabolismo de lípidos.

Biosíntesis de

Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los programas de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes de farmacia, el desarrollo de esta práctica, ya que profundizan y analizan la relación e

importancia que guardan los lípidos en las reacciones del catabolismo y anabolismo para e aporte de energía metabólica. En esta práctica, los estudiantes profundizan en los diferentes tipos de lípidos que se encuentran en los tejidos biológicos. Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)

MATERIALES VIDRIO

DE MATERALES BIOLOGICO

REACTIVOS

EQUIPOS

180 ml de etanol

Estufa y malla

Probeta de 100 ml

3 huevos

Agitador de vidrio

20 gramos de cerebro 200 ml de éter fresco de res.

centrifuga


50 ml de KOH 1.5N

Perlas de vidrio


50 ml de acetona

Varilla para reflujo

Vaso de precipitado de 600 ml plástico

50 ml de HNO3

Corchos orificios


Solución de molibdato Microcoscopio (1) de amonio


50 ml de acetona

Plancha de calentamiento

espátula

20 ml de etanol

Papel filtro

con

112


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Erlenmeyer de 250 ml

mechero

20 ml de éter

Pipetas de 10 ml Soporte universal y

10 ml de acetona

pinzas. Pinzas para la varilla refrigerante

10 ml de HNO3

Pinzas para crisol

Solución de molibdato de amonio

Crisol o cápsula mediana y pequeña.

30 ml de acetona

Pinzas de madera

10 ml de HCl

Embudos

50 ml de NaOH al 30 % Reactivo Fehling

Ay

B

DE

Tabla 45: reactivos práctica 11


Ubicación: Página principal del curso, tópico Unidad 3 Video Beta- oxidación de ácidos grasos insaturados

Seguridad Industrial

REACTIVO

PROTECCION

Solventes orgánicos: acetona, éter




RIESGO

Metodología Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica: 1. Capítulo 1 y 2 de la Unidad 1: Biomoléculas del módulo del curso.

113


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Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para e


Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe que contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica y tabla de resultados en blanco.

Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la práctica #11 de laboratorio para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que e desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación de informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor. Procedimiento:

Procedimiento #1: reconocimiento de colesterol y fosfolípidos a partir de la yema de huevo Preparar una solución de alcohol éter así: 40 ml de alcohol y 20 ml de éter.

Tome un huevo, hacer un orifico en uno de los extremos y a través de él deje salir la clara Luego transfiera la yema a un vaso de precipitado que contenga una mezcla de 40 ml de etano y 20 ml de éter, disuelva bien la yema, agitando durante 10 minutos, filtre a través de papel filtro y recoja el filtrado en un vaso de precipitado seco.

Prepare una solución de mezcla de etanol- éter (2:1), tome 14 ml de etanol y mezcle con 7 ml de éter. Lave el residuo con 20 ml de de la mezcla de etanol- éter (2:1).

Evapore a sequedad el filtrado anterior sobre una plancha de calentamiento o a baño maría cuidando de no dejar quemar el residuo. Disuelva el residuo en 5 ml de éter y viértalo poco a poco y agitando en un vaso de precipitado que contenga 20 ml de acetona. Se debe formar un precipitado que generalmente es fosfolipidos. Centrifugue y recoja el sobrenadante en un vaso de precipitado de 50 ml. El precipitado debe recogerlo guardarlo para la prueba de fosfolipidos.

1.1 Reconocimiento de colesterol

Evapore el liquido anterior a baño maría, hasta que se forme una pasta Agregue 15 ml de de solución de KOH al 1.5 N, agite bien y transfiera a un erlenmeyer de 250 ml y deposite en é perlas de vidrio y caliente la mezcla a reflujo durante 20 minutos. Enfriar y añadir 20 ml de 114


114/149

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éter, agitar durante 10 minutos y centrifugar. El precipitado es jabón, descartar. Guardar el sobrenadante que contiene colesterol.

Tome el sobrenadante, evapórelo en una baño de vapor, lejos de la llama, cuando ya quede sólo el residuo, adicionar

5 ml de alcohol y pasar la solución a un tubo de centrifuga y centrifugar durante 5 minutos Pasar el líquido sobrenadante a otro tubo de centrifuga y añadir agua gota a gota hasta que se forma bastante precipitado. Dejar en reposo durante 15 minutos y centrifugar nuevamente y decantar el líquido sobrenadante, guardar y marcar como sobrenadante de colesterol. Recoger el precipitado.

1.2 Reconocimiento de fosfoglicéridos o fosfolípidos

Utilice el resto del precipitado. Paséelo a un crisol y caliente sobre un mechero hasta

convertirlo completamente en cenizas. Disolver el residuo en solución 5 ml dede agua destilada 5 gotas de HNO3 concentrado, filtren y agregue al filtrado 1 ml de Molibdato deyamonio. Observe la coloración y la formación de precipitado.

Cuestionario: • • • • •

Describa microscópicamente el colesterol es el colesterol una sustancia saponificable? explique su respuesta. que significa la prueba del glicerol sobre los lípidos de la yema de huevo? que significa la prueba para fosfato sobre los lípidos de la yema de huevo? Explique los resultados.

2. Procedimiento #2: extracción de lípidos del cerebro

Pese 4 gramos de cerebro fresco de res. Repártalos en dos tubos de centrifuga, macérelos con ayuda de un agitador suavemente contra las paredes del tubo. Agregue 5 ml de acetona, mezcle durante 10 minutos, centrifugue a 3000 rpm por dos minutos. Decante la acetona en un erlenmeyer de 50 ml y colóquele el nombre de extracto I.

Con el residuo, agregue 10 ml de acetona, vuelva a centrifugar y el sobrenadante colóquelo en el vaso de extracto I

Coloque el residuo de los tubos a baño maría por 10 minutos y agréguele 5 ml de éter, mezcle centrifugue a 3000 rpm por 1 minuto, decante el éter en otro vaso de 50 ml marcado como extracto II.

Al residuo adiciónele 5 ml de éter y vuelva a centrifugar y el líquido deposítelo en el vaso del extracto II. Repita nuevamente la operación.

Extienda en los tubos el residuo y séquelo a baño maría, una vez secos adicione 5 ml de etanol 115


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al 97% caliente, mezcle bien, centrifugue a 3000 rpm a 2 minutos, decante el etanol en un tercer vaso de 50 ml y marcado como extracto III. Repita una vez más el procedimiento desde la adición de los 5 ml de etanol caliente.

2.1 separación de los lípidos del extracto II

Evapore a baño maría el extracto II. Agregue al residuo 5 ml de acetona, mezcle bien y centrifugue por 2 min. Decante el líquido en el vaso de extracto I.

Al residuo que queda, agregué 5 ml de éter, mezcle bien, y centrifugue, decante el liquido en e vaso del precipitado extracto II.

Al residuo adicione, 3 ml de etanol caliente, mezcle y centrifugue y decante el etanol en el vaso de extracto III. Evapore los extractos II y III, hasta sequedad. (en baño maría), Tome el extracto II, adicione 4 ml de etanol caliente y realice las pruebas para fosfolipidos.

2.2 prueba para fosfolípidos:

Coloque el extracto en una cápsula de porcelana, evapore el etanol, continúe calentando hasta que el residuo quede completamente en cenizas, adicione 5 gotas de HNO3, y 5 ml de agua destilada, disuelva bien las cenizas y filtre, al filtrado adicione 5 ml de Molibdato de amonio observe la coloración y formación de precipitados.

Cuestionario: Para qué clase de lípidos es positiva esta prueba? Que sustancia se forme en el precipitado?

Dentro de la composición de los lípidos que átomo o grupo de átomos es la que se identifica con esta prueba.

2.3 prueba para glucolipidos y esfingolipidos

Disuelva el extracto III, en 3 ml de etanol, calentando para disolverla, agregue 4 ml de agua y

realice: Agregue 1 ml de HCL concentrado, agite bien, caliente a baño de agua hirviendo por 15 minutos. Deje enfriar y adiciónele gota a gota NaOH al 30% hasta alcalinizar (con tiras de pape indicador de pH), realice la prueba de Fehling. Cuestionario: 1. Qué indica esta prueba. Para quién es positiva esta prueba, que se deduce de la prueba. 2. que esperaban encontrar en el extracto I 116


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Sistema de Evaluación



•


Evaluación grupal: •

el grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía


Ítem Evaluado


Valoración Baja


Valoración Media

Valoración Alta



Máximo Puntaje

10

(Puntos = 7.0)


Estructura del Informe( portada, introducción, objetivos, desarrollo( resultados y


(Puntos = 0).


(Puntos = 0)



(Puntos = 5.0 )

(Puntos =10)



20

5

117


117/149

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(Puntos = 0.5 )

análisis) , conclusiones y referencias)

(Puntos =1.0)

máximo de hojas 8



El informe no da


Aunque presenta resultados El informe

respuesta a los ynoanálisis de resultados lineamientos de las son pertinentes. Se estos prácticas de laboratorio. evidencia la ausencia de análisis y deducción. Fines del informe

(Puntos = 0)


(Puntos =4)

presenta excelenteuna articulación entre los resultados y el análisis de 45 resultados. Se evidencia la profundidad de los análisis.

(Puntos = 8)

Referencias





5

90




118


118/149

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PRÁCTICA No. 12- FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS EN SUS PRINCIPALES CONSTITUYENTES: CARBOHIDRATOS, LÍPIDOS, PROTEÍNAS Y ÁCIDOS NUCLEICOS12 (Opcional, puede hacerse en lugar de las prácticas practicas #1, 6, 7, 8,10 y 11. Tipo de practica Porcentaje de evaluación Horas de la practica Temáticas de la práctica

Presencial Autodirigida Remota 30% 16 horas divididas en 3 y 4 sesiones. Unidad 1, 2, y 3 del módulo del curso.


Propósitos

Reconocer a los aminoácidos como unidades estructurales de la proteínas y su importancia en los diferentes procesos metabólicos

Reconocer a los nucleótidos como unidades estructurales de lo ácidos nucleicos y su importancia en los diferentes proceso genéticos.

Reconocer a los lípidos como unidades estructurales d membranas biológicas y su importancia en los diferentes proceso metabólicos.

Reconocer a los monosacáridos como unidades estructurales d las polisacáridos y su importancia en los diferentes proceso metabólicos.

Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas presencia de aminoácidos y enlaces peptídicos, diferentes tipos d lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos en las muestras.

Establecer relaciones entre la estructura y la función de las de la biomoléculas.

Objetivos

Que el estudiante reconozca a los aminoácidos como unidade estructurales de las proteínas y su importancia en los diferente 12


119


119/149

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procesos metabólicos.

Que el estudiante reconozca como unidades estructurales de lo ácidos nucleicos y su importancia en los diferentes proceso genéticos.

Que el estudiante reconozca a los lípidos como unidade estructurales de membranas biológicas y su importancia en lo diferentes procesos metabólicos.

Que el estudiante reconozca a los monosacáridos como unidade estructurales de los polisacáridos y su importancia en lo diferentes procesos metabólicos. Que el estudiante analice, mediante reacciones

cualitativa

coloreadas la de presencia de aminoácidos y enlaces peptídico diferentes tipos lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos en la muestras. Que el estudiante establezca relaciones entre la estructura y función de las de las biomoléculas.

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente lo resultados observados en cada prueba cualitativa y relaciona

marco teórico y los resultados para dar el respectivo análisis. El estudiante conceptualiza en forma precisa la relación que tien cada prueba y la estructura de las biomoléculas.

El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a través d la elaboración de informes escritos.


El estudiante obtendrá su calificación del respectivo pre inform personal como resultado del estudio independiente. El estudiante resolverá los respectivos cuestionarios dados.

El estudiante presentará en forma escrita el informe del respectiv laboratorio en forma grupal en donde sobresalga el análisis de 120


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resultados. fundamentación Teórica

Debido a las diferencias químicas que existen entre las moléculas de carbohidratos, lípid proteínas y ácidos nucleicos, éstas presentan diferente solubilidad en solventes orgánico además en ácidos semejantes al tricloroacetico (ATA) de acuerdo con la temperatura. Es pos entonces utilizar tales solubilidades diferenciales para separarlos, una vez que los tejidos han s triturados y se han roto sus membranas.

Acción del ácido tricloroacetico a baja temperatura •

Sobre carbohidratos

A baja temperatura los monosacáridos son estables en medio ácido, mientras que si se tratan caliente, sufren deshidratación produciéndose los furfurales.

Los polisacáridos en medio ácido sufren hidrólisis del enlace glicosídico, reacción que aumenta velocidad a medida que se eleva la temperatura. A temperaturas interiores a 4°C, la velocidad hidrólisis es tan lenta que para fines prácticos se considera que no ocurre reacción.

En general se puede decir que los carbohidratos son solubles en solución de ácido tricioroacétic 20% a temperaturas inferiores a 4°C y que no sufren cambios químicos en estas condiciones. •

Sobre lípidos

Según sus propiedades fisicoquímicas, estos compuestos son poco solubles en solucio acuosas y no son extraídos si se trata el tejido con soluciones acuosas de ácido tricioroacético. •

Sobre proteínas

Forman sales insolubles en ácidos como tricloroacetico o perclórico, por tanto no son solubles soluciones de ácido tricioroacético al 20% en frío. •

Sobre ácidos nucleicos

Lo mismo que las proteínas, estos ácidos son insolubles en soluciones frías de ác tricloroacetico. Por otra parte el ácido desoxirribonucleico (DNA) está unido a histonas, lo cua hace más insoluble en estas condiciones.

En conclusión, al tratar un tejido previamente triturado con ácido tricioroacético al 20% y a 4° someter a centrifugación la suspensión resultante, en el sobrenadante se obtienen los azúca mientras que los lípidos, proteínas y ácidos nucleicos quedan en el residuo.

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Acción del etanol-éter-cloroformo (2: 2: 1 v/v)

Si el residuo de la extracción con ácido tricloroacético a 4°C, se trata con solución de etanol-é cloroformo, al solvente solo pasan los lípidos, mientras que las proteínas y los ácidos nuclei quedan en la fase sólida.

Acción del cloruro de sodio al 10% en caliente

Si el residuo anterior se suspende en una solución de NaCI al 10% y se calienta en baño m (92°C) durante 40 minutos, se desnaturalizan las proteínas, en tanto que los ácidos nucleic principalmente el ribonucleico (RNA), quedan en solución. Por este procedimiento es pos separar las proteínas de los ácidos nucleicos. Si al sobre nadante se le agrega ahora eta absoluto en un volumen igual al doble de la solución original y se enfría en baño de hielo dura 10 minutos, se obtiene un precipitado que puede ser separado por centrifugación y que contiene ácidos nucleicos.

1. CARACTERIZACIÓN DE LAS FRACCIONES OBTENIDAS A PARTIR DE DIFERENT TEJIDOS Fundamento teórico Carbohidratos

Los organismos vivos contienen carbohidratos que pueden estar formando polisacáridos reserva, pueden ser componentes estructurales o pueden estar participando en el metabolismo forma monomérica. Las propiedades químicas de tales compuestos permiten diferenciarlos, así: • •

Los polisacáridos son solubles en soluciones acuosas ácidas, pero insolubles en etanol. Los polisacáridos como el almidón, el glicógeno y los dextranos, forman compues coloreados característicos cuando se combinan con yodo molecular.

A pesar de que la naturaleza de estos complejos no está bien definida, la evidencia dispon indica a formación de complejos de absorción entre las cadenas helicoidales del polisacárido yodo. Para que haya estructura helicoidal se necesita por lo menos una cadena con ocho unida

de monosacárido. Los polisacáridos que a todo lo largo de su molécula muestran estructura helicoidal, dan colorac azul intensa, ej. la amilosa. Aquellos que son ramificados con hélices interrumpidas, produ coloraciones menos intensas, ej. la amilopectina. Los altamente ramificados con segmentos co de ramificación, producen color pardo o rojizo, ej. el glicógeno.

Reacción de Molisch 122


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Un azúcar tratado con a-naftol y ácido sulfúrico concentrado, produce una coloración violeta. presume que el ácido sulfúrico actúa como deshidratante formando derivados del tipo de furfurales que reaccionan con el a-naftol para dar productos coloreados.

Reacción de Benedict Azúcares reductores tratados con solución alcalina suave (citrato-carbonato de sodio) de cúprico, lo reducen a óxido cuproso de color ladrillo.

Lípidos

En cuanto a solubilidad, los lípidos son insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos

Los triglicéridos forman un complejo coloreado (vino tinto) con el ácido hidroxámico y el hierro medio ácido y oxidante. Los hidroxiesteroides con insaturación en la posición 5 reaccionan con el anhídrido acético para ésteres, que en medio sulfúrico se deshidratan produciendo una coloración verde.

Los fosfolípidos por acción del NaOH se hidrolizan produciendo fosfatos inorgánicos, que co ácido molíbdico dan fosfomolibdato y estos, por acción de reductores como el ácido 1,2 aminonaftolsulfónico o el ácido ascórbico, producen complejos de óxidos de molibdeno de c azul.

Si los jabones resultantes de la hidrólisis alcalina se someten a la acción del éter, los jabones sedimentan y en el sobrenadante queda el glicerol. Los compuestos que en su estructura tie +2

n forman complejos con iones metálicos como el Cu grupos ( > CHOH) porcaliente tanto sy sobrenadante anterior se evapora al baño de maría el residuo se disuelve en agua acidifica con HCI; si los jabones no se habían separado totalmente, los ácidos grasos de estos separan en una capa insoluble en agua. Después de evaporar la capa acuosa, el residuo disuelve en etanol y por la adición de solución de sulfato de cobre se formará un quelato de co de color verde, luego de agregar NaOH 0.1 N.

Ácidos nucleicos •

Hidrólisis 123


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Los álcalis diluidos (0.3 a 1.0 N) hidrolizan los enlaces éster del ácido ribonucleico.

En cambio los enlaces éster del ácido desoxirribonucleico son relativamente estables, lo mismo los enlaces N-glicosídicos de DNA y RNA. La facilidad de hidrólisis en el RNA parece e asociada a la presencia de hidroxilos en los carbonos 2’ y3’, lo cual permite la formación intermedios cíclicos 2’, 3’-fosfonucleótidos, que finalmente dan los comple monofosfonucleótidos- 2’ o 3’. Como la deoxirribosa del DNA no forma tales intermediarios, relativamente estable en presencia de álcali diluido. La acidificación de la solución después tratamiento alcalino precipita las moléculas de DNA intactas. Los nucleótidos obtenidos en la hidrólisis anterior fluorecen a la luz ultravioleta.

Con orcinol

Los nucleótidos del RNA, debido a la presencia de ribosa, reaccionan con el reactivo ácido

orcinol verdosa.(cloruro férrico en HCI concentrado + solución alcohólica de orcinol), dando colorac

Desnaturalización de proteínas

Por acción de pHs extremos se destruyen los puentes de hidrógeno que mantienen la estruc secundaria de las proteínas. Las proteínas a temperaturas mayores de 50°C precipitan, formación de agregados que resultan de la destrucción de la estructura secundaria y terciaria.

Millon

Las proteínas que contienen reaccionan con mercurio disuelto en ácido nítrico, producie nitroderivados mercuriales detirosina color rojo.

Ninhidrina

Los grupos amino terminales de las proteínas reaccionan con la ninhidrina en caliente, da complejos de color violeta. En ellos, el amoníaco desprendido reacciona con una molécula ninhidrina en estado oxidado y con otra en estado reducido.

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Biuret

Los nitrógenos del enlace peptídico forman complejos coloreados con los iones cúpricos en me alcalino.

Reacción Xantoproteica

Esta reacción se basa en la nitración del anillo bencénico por el HNO 3 concentrado, da

derivados pero amarillos deamarillo nitrobenceno. Lasse proteínas queencontienen y triptófano dan Pe reacción, el color resultante transforma naranja sitirosina se le adiciona NH 4OH. nitrar la fenilalanina se requiere H2SO4 como catalizador.

2. EXTRACCIÓN DE LA YEMA DE LÍPIDOS DEL HUEVO

La separación de los lípidos es extremadamente difícil por extracción con vanos solven orgánicos puros. Se hace uso de la propiedad que tienen la mayoría de los lípidos de ser solub en mezclas de etanol: éter o etanol: cloroformo. La yema de huevo contiene buenas cantidades grasas neutras, lecitinas y colesterol.

4 (HPO

Las lecitinas tienen un pH aproximadamente neutro, ya que contienen grupos ácidos básicos (Colina) formando Zwiteriones muy polares. Se dispersan coloidalmente en agua contraste con las grasas neutras que no se emulsionan. Las lecitinas se precipitan a partir de u solución etérea por adición de acetona y su reconocimiento se basa en un test para saponificac y en un test para Colina. Las esfingomielinas también tienen Colina pero son solubles en éter y presentan en cantidades despreciables en el huevo crudo.

El colesterol no precipita por tratamiento con acetona de una solución etérea y como no saponificable después del tratamiento con KOH puede extraerse con éter, en tanto que triglicéridos se han saponificado dando jabones solubles en agua. Para el reconocimiento

colesterol se aplica el test de Liebermann-Burchard. El colesterol requiere de 15 a 20 minutos p el desarrollo de un color verde profundo, precedido de un color lila. Se requieren condiciones completamente anhidras para esta reacción.

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3. DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS EN HARINAS DE LEGUMINOSAS Y CEREALES POR EL MÉTODO DE MICRO KJELDAHL Método Kjeldahl

Este método, diseñado para la determinación de nitrógeno total, puede aplicarse al análisis proteína bruta de una muestra o de proteína verdadera, haciendo una extracción previa de ést también determinando el nitrógeno no proteínico.

El resultado de los análisis por Kjeldahl se expresa como proteína bruta, multiplicando el porcen de nitrógeno en la muestra por 6.25. Esta conversión se basa en el contenido promedio nitrógeno del 16% de muchas proteínas. Aunque este promedio puede no ser válido para proteí específicas purificadas, es suficientemente exacto para la mayoría de propósitos. Para la determinación del nitrógeno presente en la muestra, es necesario hacer la digestión + NH4 ,

2 e iones compuesto COcatalizadora. por se tratamiento en calienteel con H 2SO4deconcentrado presencia dehasta mezcla Cuando trata de determinar nitrógeno compuestosy contengan enlaces N-N, NO y NO2, previamente debe practicarse tratamiento con agen reductores para convertirlos en grupos amina.

La cantidad de amonio producido se determina agregando un exceso de álcali a la solución ác que los contiene, con lo cual se desplazan tales iones del bisulfato amónico y en la forma hidróxido de amonio son arrastrados por una corriente de vapor de agua a un sistema cerrad absorbidos en una solución de ácido de concentración conocida.

El exceso de ácido que queda en la solución, después de haber recogido todo el amoni desprendido, se valora con un álcali de título conocido.

También el amonio desprendido puede recogerse sobre una solución de ácido bórico, y el bo ácido de amonio producido se titula por retroceso con solución de un ácido fuerte de concentrac conocida. El método que se usa en la realidad se ha ajustado a la técnica micro. Las reacciones que ocurren durante todo el proceso son: •

Digestión: N orgánico

•

Destilación:

+

   → NH 4 SO 4 H 2 SO 4   Mezcla Caral

+

CO 2

+

SO 2

+

SO 3

NH 4 HSO 4 + NaOH        → NH 4 OH + NaHSO 4 Arrastre con Vapor

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•


Absorción: NH 4 OH + H 3 BO 3  → NH 4 H 2 BO 3

•

+

H 2O

Titulación: NH H BO 4

2

+

HCl  → NH Cl + H BO

3

4

3

3

La suma miembro a miembro de las ecuaciones de absorción y titulación, da la ecuación defini de titulación: NH 4 OH + HCl     → NH 4 Cl + H 2 O Indicador

El método es reproducible, requiere el tratamiento de muestras con un contenido de proteína ma de 3 mg y puede calificarse como consumidor de tiempo y dispendioso en general. Sin emba como es posible conocer el contenido de nitrógeno no proteínico (haciendo una extracción pre de este y determinándolo en la solución de extracción), se obtienen entonces valores basta exactos del contenido real de proteína.

Se recomienda usarlo para determinar proteína en mezclas crudas y relativamente grandes, p no es rápido ni muy aconsejable para aplicarlo a gran número de muestras de proteína solu relativamente pura. Descripción de la practica

El desarrollo de esta práctica puede reemplazar a las practicas #1, 6, 7, 8,10 y 11, ó puede ser práctica de complemento, ya que contiene el desarrollo de las principales temáticas de la Uni

1, 2, y 3 del módulo del curso. En esta práctica mediante pruebas coloreadas, se identifica los aminoácidos que componen proteínas de los extractos utilizados basados en las reacciones de los grupos R ó cadena later Se desarrolla pruebas para analizar el comportamiento y la solubilidad de proteínas tratamientos de precipitación y desnaturalización. Los objetivos de esta sección de prácticas son:

Investigar la presencia de carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos en las traccio obtenidas tejidos del animal empleado, utilizando para ello reacciones característ para cada de unodiferentes de los componentes anteriores. Extraer y caracterizar los fosfolípidos, colesterol y triglicéridos presentes en la yema de huevo.

Determinar el contenido total de nitrógeno en harinas de leguminosas y cereales utilizando método de micro Kjeldahl.

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Es de vital importancia para los estudiantes de la formación profesional y técnica de los program de ingeniería de alimentos, agroforestal, agronómica, zootecnia, producción animal y regentes farmacia, el desarrollo de estas prácticas, ya que profundizan y analizan los princip componentes de los tejidos, haciendo referencia a aminoácidos, proteínas, lípidos y áci nucleicos, temáticas de relevancia dentro de un curso general de bioquímica para los programas las ciencias básicas biológicas. Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos) Tabla 46: reactivos práctica 12.

Material de vidrio

Material biológico

Reactivos

Equipos

Probeta de 100 ml

Huevos

ATA al 10%

Equipo de digestión

Arena lavada

para proteínas. Centrifuga

Agitador de vidrio

Harina de leguminosas.


Etanol del 95% , Éter etílico. Plancha de calentamiento


NaCI al 10%, HCI 2N, Ninhidrina al 0.2%


etanol éter cloroformo (2: 2:1)


Etanol, Solución de lugol, Reactivo de Molish, Acido sulfúrico concentrado,

Vaso de precipitado de 50 ml espátula

Equipo de titulación

Reactivo de Benedict Reactivo de Millón Reactivo de Biuret

Erlenmeyer de 250 ml

NaOH al 15% y 50%, Hidroxilamina al 10%, KOH 2N. FeCl3 al 5% Cloroformo, Anhídrido acético, AcOH 10%. 128


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Fenolftaleína , Acido molíbdico, Acido 1,2,4aminonaftolsulfónico Pipetas de 10 ml

Ácido nítrico concentrado, Hidróxido de amonio concentrado, Almidón , Glucosa

Soporte universal y pinzas.

o ácido ascórbico (150 mg/100 mI), Bencidina al 4% en ác. acético , Triglicéridos, Colesterol, Lecitina, Albumina

Pinzas para la varilla

Reineckato de amonio al

refrigerante

2% en etanol, Glicina, Tirosina, Solución de pentosa

Pinzas para crisol

Mezcla de alcohol-éter (2:1), Éter etílico, Acetona, Ba(OH)2 saturado, Acido acético al 10%

Crisol o cápsula mediana y pequeña.

Mezcla catalizadora Sysoev: K2SO4 100 g,

Pinzas de madera

CuSO4 25 g, KMnO4 7.5 g y Se metálico 0.5 g.

Embudos

H2SO4 concentrado, del 98% y d = 1.84 g/ml Solución de ácido bórico al 4%. Indicador “Taschiro”: rojo de metilo (al 0.2% en Etanol) 1 volumen + verde bromo resol (al 0.2% en de Etanol) 5 volúmenes. NaOH al 50%. HCI 0.01 N.

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Seguridad industrial

REACTIVO

PROTECCION

Ácidos inorgánicos concentrados.


Catalizador y otros reactivos

Gafas de seguridad, tapabocas con

del método de Kjeldahl

filtro de carbono, vapores ácidos. mascara para

Solventes orgánicos: acetona, éter


RIESGO

Metodología Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica: 1. Unidades 1,2 y 3 del curso de Bioquímica.

Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuación encontrará los pasos a seguir para


Trabajo individual: el estudiante obtiene las guías de laboratorio, prepara un pre informe contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la práctica y ta de resultados en blanco.

Trabajo En grupo de trabajo, todos estudiantes la práctica de laborato para ellogrupal: previamente deben identificar los los materiales que realizan se requiere. Tenga#12 presente que desempeño individual como grupal, serán tenidos en cuenta en la rúbrica de evaluación informe de laboratorio. Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor.

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Procedimiento

Cada grupo hará el fraccionamiento químico sobre un tejido determinado. Para comparar diferentes tejidos desde el punto de vista del contenido de carbohidratos, lípidos, proteínas y áci nucleicos, deberá confrontar sus resultados con los obtenidos por los otros grupos.

NOTA: Las diferentes fracciones obtenidas en esta práctica, deben guardarse para la siguie sesión de laboratorio. A cada grupo se le entregará una muestra de tejido en ATA al 10% con los siguientes datos: • • •

peso del tejido. origen del tejido. ATA al 10% adicionado (1,5 mI/g de tejido).

Este tejido se tratará conforme al diagrama esquemático del método para fraccionar un tejido sus constituyentes que se encuentra en la siguiente página. Cada grupo recibirá cinco frascos donde guardará y marcará adecuadamente cada fracción obtenga. Cuando tenga que evaporar las fracciones, lo hará en una plancha de calentamiento sobre malla de asbesto; para secar, debe utilizar la estufa.

Expresión de resultados

Compare sus resultados con los obtenidos por los demás grupos y con los datos bibliográficos. acuerdo con la función fisiológica y con los resultados, diga cuáles son los tejidos cualitativamente contienen más proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y carbohidratos.

Cuestionario

1. ¿Por qué se recomienda mantener los tejidos que se fraccionan a baja temperatura? 2. ¿Qué sucede al contenido celular si la temperatura a que se mantiene es de 37°C? 3. ¿Cuál es el fundamento de la centrifugación? Haga una explicación breve de los principios.

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figura 2: Extracción de biomoléculas.

1. CARACTERIZACIÓN DE LAS FRACCIONES OBTENIDAS A PARTIR DE DIFERENTES TEJIDOS

Con las muestras M1, M2, M3, M4 y M5 obtenidas en la práctica anterior, se harán las siguien pruebas de caracterización.

Carbohidratos: Muestras M1, M2 y patrones de mono y polisacáridos.

Lugol : A una fracción de cada una de las muestras agregarles 3 gotas de solución de Lu Observar las coloraciones. A otras porciones iguales de estos compuestos, adicioflanes 1 ml HCI 2N y colocarlos al baflo maría durante 25 minutos. Dejar enfriar y agregarles nuevame Lugol. Obsérvese los resultados y explíquelos en el informe.

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Molisch

A una nueva fracción de los compuestos anteriores, agrégueles 1 ml de agua destilada, 2 gotas reactivo de Molisch. Mezcle cuidadosamente y con los tubos inclinados agregue 1 ml de ác sulfúrico concentrado de manera que se forme una capa de ácido debajo de la fase acuosa. An el color del anillo formado en la interfase.

Benedict : Coloque al baño maría durante 2 minutos, fracciones de las muestras y patrones, co ml de solución de Benedict. Observe los resultados y continúe calentando por 15 minutos. nuevo observe los tubos. Lípidos: Muestra M3 y patrones de lecitina, colesterol y triglicéridos.

Ácidos hidroxámicos: A una fracción de las muestras, agregue 1 mI de hidroxilamina al 10% cual se le ha incorporado 0.01% del indicador timolftaleína. Adicione lentamente solución de Na

al 10% hasta permanente. Caliente en baño maría por 10 al chorr adicione HCI alcolor 10%azul lentamente y con agitación, hasta desaparición del minutos, color azul.enfríe Agregue una gotas del mismo ácido en exceso. Por último adicione 0.5 ml de solución de FeCl 3 al 5%. Obse los cambios de coloración que ocurren y anote los resultados.

3.2.2 Prueba de Lieberman-Burchard: Tome una fracción de cada una de las muest agrégueles 3 ml de cloroformo, mezcle bien. Agregue después 1 ml de anhídrido acético, agi adicione con cuidado 3 gotas de ácido sulfúrico, por las paredes del tubo. Observe la coloración la interfase al minuto y a los 15 minutos. Explique.

3.2.3 Saponificación: A una cantidad análoga a la anterior de las fracciones, agregue 3 ml NaOH al 15% coloque en la boca del tubo una estera de vidrio y ponga al baño maría durante minutos. Añada 15 ml de éter etílico y filtre los jabones resultantes. Después de la hidró neutralizar con ácido acético al 10% usando fenolftaleína como indicador.

Colina: A 10 ml del filtrado anterior añadir 6 ml de Reineckato de amonio al 2% en etano colocarlo en nevera por 30 minutos hasta que cristalice. Ácidos nucleicos

Muestra M5: Tome una tracción de la correspondiente a los ácidos nucleicos, adicione 3 mI

KOH 2 N y coloque en la del tubo una esfera de vidrio. tubo al baño maríaéste dura 30 minutos. Acidifique la boca solución con HCI y observe si se Ponga forma el precipitado. Separe centrifugación.

Pentosas: A 0,5 ml del sobrenadante anterior adicione 0,5 ml de solución de bencidina al 0,4% ácido acético caliente la solución al baño maría durante 10 minutos, colocando una bola de vi en la boca del tubo. Observe la coloración. Repita la experiencia con 0,5 ml de solución patrón 133


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pentosa.

Fosfatos: A 1 ml del mismo sobrenadante acidificado, agregar 1 ml de ácido molibdico, mez

bien y después de dejar en reposo 10 minutos adicione 0,5 ml de ácido 1,2,4-aminonaftolsulfón o 1 ml de ácido ascórbico. Observe la coloración.

Proteínas Muestra M4 y patrones de proteína y de aminoácidos.

Millon: A una tracción de la muestra y de los patrones, suspendidas en 1 mI de agua, agregu gotas del reactivo de Millon; caliente durante unos minutos al baño maría; observe el precipitado

Ninhidrina: A una fracción de la muestra y los patrones agregue 1 ml de la solución de ninhid

al 0,2%. Caliente al baño maría durante 10 minutos y observe el color. Biuret: Tome una fracción de la muestra y de los patrones, agregue 1 ml del reactivo de Biu Mezcle, espere 10 minutos y observe el color.

Xantoproteica : Caliente una tracción de la muestra y de los patrones con 1 ml de ácido nít concentrado, enfríe y observe el color. Agregue cuidadosamente un exceso de hidróxido de amo concentrado. Observe la interfase. Expresión de resultados

De acuerdo con los resultados, deduzca qué tipo de polisacáridos, aminoácidos en las proteín lípidos y ácidos nucleicos están presentes en el tejido.

Cuestionario

1. Explique la reacción con el reactivo de Lugol, de las fracciones de carbohidratos y patron antes y después del tratamiento con HCI 2N. 2. ¿Por qué el colesterol no es saponificable? 3. Escriba las reacciones de las diferentes pruebas realizadas en esta práctica. 4. ¿En qué tejidos se almacena el glicógeno? y ¿cuál es su función?

5. Si en su muestra de proteínas están presentes sales de amonio, ¿Cuál de las reacciones reconocimiento de aminoácidos no se debe usar? Dé sus razones. 134


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EXTRACCIÓN DE LA YEMA DE LÍPIDOS DEL HUEVO Procedimiento Trate la muestra como se indica en el esquema de extracción:

figura 3: Extracción de lípidos de la tema de huevo.

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Preparación de Lecitina : Amasar la yema de huevo cocido y mezclarla con 40 ml de la mezcla alcohol- éter (2:1). Dejar reposar 10 minutos con agitación ocasional, filtrar con papel humedec con alcohol. Remover el residuo del papel filtro y mezclarlo con otros 10 ml de la mezcla de alcoh éter y filtrar. Combinar los dos filtrados en una cápsula previamente pesada.

El filtrado se evapora hasta sequedad en un baño maría. Pesar y disolver el residuo en 5 ml de é y agregar esta solución lentamente y con agitación a 15 ml de acetona y con ayuda de un pol agitar de manera que las partículas de lecitina se aglomeren y formen una bola. Guardar la soluc de éter-acetona para la segunda parte.

Solubilidad : Mezclar un poco de lecitina con agua. Observar que se dispersa formando coloide. Hidrólisis: Agregar 20 ml de Ba(OH)2 saturado al resto de lecitina y luego hidrolizar durante 30 en un erlenmeyer con varilla para reflujo. Después de la hidrólisis neutralizar con CH 3COOH al 10% usando fenolftaleína como indica Filtrar y descartar el residuo. Al filtrado añadir 6 mI de reineckato de amonio al 2% en etan colocarlo en la nevera por 20 ó 30 minutos hasta que cristalice.

Preparación del Colesterol : La solución de éter-acetona obtenida durante la preparación de lecitina, evaporarla en un baño de vapor hasta obtener una pasta. (El residuo no debe o’er a éte acetona). Enfriar y pesar. Añadir 10 ml de KOH alcohólico al 10%, perlas de vidrio y colocar reflujo por 30 mm. Enfriar y luego añadir 30 ml de éter. Filtrar el precipitado de jabón si se forma solución de éter contiene entonces el colesterol.

Evaporar hasta sequedad en un vidrio de reloj, descartar los restos de agua o secar con un pa de filtro.

Extraer el colesterol calentando el residuo con 5 ml de alcohol en un baño de vapor y pasa solución a un tubo de centrífuga de 15 ml. Al residuo sobre el papel agregar otros 3 ml. de alco con el fin de lograr una extracción completa, combinar los dos extractos alcohólicos, centrifu durante 5 minutos. Pasar el líquido sobrenadante que contiene el colesterol a otro tubo centrífuga y añadir agua gota a gota hasta que no se forme más precipitado. Dejar en rep durante 15 minutos y centrifugar. Decantar el líquido sobrenadante.

Si se desea, el colesterol puede purificarse por recristalización con unos pocos mililitros de alco caliente. Cuando esté frío, la adición de unas gotas de agua asegura la cristalización. Centrifug Dejar secar el precipitado y sobre el producto seco realizar el test de Liebermann-Burchard así un tubo de ensayo seco colocar unos pocos mg de colesterol, 1,5 ml de cloroformo anhidro, 0,5 de anhídrido acético y 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. El desarrollo del color generalme demora de 15 a 30 minutos y durante este tiempo debe colocarse en la oscuridad.

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Calcular el porcentaje de lípidos totales, lecitina, colesterol y triglicéridos presentes en la yema huevo. Comparar con los valores reportados en la bibliografía. Escribir las reacciones de caracterización de cada uno de los lípidos extraídos.

Cuestionario 1. 2. 3. 4. 5.

¿Cuáles son los productos de hidrólisis completa de la lecitina? Si la extracción del colesterol no se realiza en condiciones anhidras ¿qué resultado esperaría ¿Por qué la lecitina forma una emulsión en presencia de H2O? ¿Es el colesterol saponificable? Explique su respuesta. Escriba las estructuras del colesterol, ácido desoxicólico, estradiol, progesterona, vitaminas

D ¿Qué similitud estructural encuentra entre ellas? de extracción utilizado? 6. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del método

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS EN HARINAS DE LEGUMINOSAS Y CEREALES POR EL MÉTODO DE MICRO KJELDAHL Digestión En un balón de digestión marcado colocar en su orden lo siguiente: •

• •

Muestra de harina de leguminosa, 30 a 35 mg; o en su defecto muestra de harina de cereal a 50 mg Mezcla catalizadora, aproximadamente 100 mg. H2SO4 concentrado, 1 ml.

Para todo el grupo se correrán únicamente dos blancos. En tales balones se coloca lo mism excepción de la muestra.

Llevar los balones al digestor, calentar al principio suavemente-aproximadamente durante minutos-con el fin de sacar por evaporación la mayor parte de la humedad que acompaña a

muestra. Aumentar luego gradualmente el calor hasta una tal, irritación que los vapores de S (precaución: estos son producidos por descomposición del temperatura H 2SO4, causan y producen de no hacerse la operación en vitrina) no alcancen sino la mitad del cuello del balón de digestión

Mantener estas condiciones aproximadamente por una hora, hasta obtener una solución de c verde esmeralda. Dejar enfriar los balones al aire.

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Destilación y absorción

En la figura 66 se muestra el aparato correspondiente. Al balón del generador de vapor se agre perlas de vidrio o trozos de corcho o vidrio para ayudar a regular la ebullición.

Operar el generador de vapor hasta alcanzar un flujo constante de vapor, lo que se consig aumentando o disminuyendo el calor. Entre tanto, la llave de doble paso debe conducir el vapo vertedero. Agregar con cuidado un poco de agua destilada al balón de digestión y agitar p disolver la suspensión. Transferir totalmente la mezcla digerida al balón de destilación que ti cuello esmerilado.

Lavar unas tres veces el balón de digestión con pequeñas porciones de agua destilada y agre estas aguas de lavado al balón de destilación.

Medir 10 ml de H 3BO3 al 4% en un erlenmeyer de 125 ml, agregar 3 gotas de indicador y coloc

debajo del refrigerante, de modo que la punta del tubo interior del mismo quede sumergida en ácido bórico, ver figura 66.

Coloca el balón de destilación que contiene la mezcla digerida en el extremo del tubo que cond el vapor y asegurarse que quede perfectamente ajustado para prevenir escapes. Levantar la t del embudo (cuidando de dejar un pequeño nivel en el mismo para que actúe como sello) p permitir el paso de aproximadamente unos 5 ml de NaOH del 50%. Tapar rápidamente el embud operar la llave de doble paso para que el vapor penetre al balón de destilación al cual se le aca de agregar la soda concentrada.

Figura 4: Montaje para destilación en el método de Micro Kjeldahl

A partir del momento en que empiecen a condensarse vapores de NH 3 en la parte superior refrigerante, lo cual se conoce porque la solución de ácido bórico vira a un violeta o a cronometre cinco minutos. Transcurrido este tiempo, baje el erlenmeyer de modo que el extre del tubo interior del refrigerante quede por encima del nivel del líquido en el erlenmeyer. Hech 138


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anterior operación, esperar tres minutos más para que el refrigerante escurra y se lave.

Con el frasco lavador, lave la punta del refrigerante y reciba estas aguas de lavado en erlenmeyer. Desmontar el balón de destilación y dejar pasar el vapor para efectos de lava Operar enseguida la llave de doble paso para dirigir el vapor hacia el vertedero.

Por último, con el frasco lavador, lavar también el extremo del tubo que conduce el vapor al ba de destilación, con el fin de dejarlo limpio para la próxima destilación.

Titulación : Titular el destilado del blanco recogido sobre el ácido bórico, con el HCI están hasta alcanzar la misma coloración que tenía antes de recibir el destilado.

El destilado de cada muestra recogido sobre el ácido bórico, que por efecto del NH3 absorbido tomado color azul, se titula con el mismo ácido, hasta obtener una coloración final igual a alcanzada con el blanco.


A partir de los volúmenes de ácido gastados en las titulaciones de la muestra (Vm) y el blanco (V calcular el porcentaje de nitrógeno total con la ecuación: % N =

(Vm − Vb) x N HCl

x 14 x 100

Peso Muestra en mg

Donde: Nt = nitrógeno total Vm = Volumen de HCI gastado en la muestra Vb = Volumen de HCI gastado en el blanco N = Normalidad del HCI y el porcentaje de proteína bruta, aplicando la ecuación: % Pr oteína Bruta

=

% Pr oteína Bruta

=

%Nt x

100 16

%Nt x 6.25

Comparar los valores obtenidos con los que se hallen en la literatura consultada para la legumin o el cereal analizado.

Incluir en su informe el contenido de proteínas en: soya, maíz, trigo, cebada, fríjol, arveja, lent garbanzo, papa y leche. 139


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Cuestionario

1. ¿Qué se conoce con el nombre de proteína bruta?, ¿de proteína real? ¿Cómo se determin

una utilizando el método de micro-Kjeldahl? 2. cada Al comparar los métodos de Biuret y Kjeldahl ¿qué ventajas y desventajas encontraría en c uno? 3. Explique porqué el contenido total de proteína determinado sobre una muestra de ha vegetal, no es el mismo que se determina sobre un extracto de la misma harina con NaCI 1% 4. ¿El factor de conversión usado (6,25) es válido cuando se determina el contenido de prote en leches? Explique su respuesta. Sistema de Evaluación Evaluación individual: •


•


Evaluación grupal:

el grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que contenga: portada, introducción, objetivos, tabla de resultados, análisis y confrontación de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografía.


Ítem Evaluado


Valoración Baja


Valoración Media

Valoración Alta



Máximo Puntaje

10

(Puntos = 7.0)

140


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(Puntos = 0).


(Puntos = 0)



(Puntos = 5.0 )

(Puntos =10)



20

5


máximo de hojas 8




(Puntos = 0)




El informe presenta una excelente articulación entre los resultados y el análisis de 45 resultados.

(Puntos =4)


(Puntos = 8)

Referencias




5

141


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90


Nota: La puntuación anterior puede ser ponderada de acuerdo al # de sesiones en cada Cead, de acuerdo a los recursos disponibles, para lo cual dicha ponderación debe guardar relación proporcional c los ítems de la rúbrica general que se presenta.

Retroalimentación

El tutor de la práctica tendrá diez (10) días hábiles para envía o entregar la respectiva retroalimentación del informe de laboratorio siguiendo lo estipulado en la rúbrica de evaluación.

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7. FUENTES DOCUMENTALES

Miguez, J. (1997). Prácticas de Bioquímica. Tunja: Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia. Munera, R: (2008). GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA. Palmira: Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Pérez, G. Navarro, Y. (1992). Bioquímica. Santa Fe de Bogotá DC: Unisur. Plummer, D. (1981). Bioquímica Práctica. Londres: Editorial McGraw-Hill. Rawn, J (2005). Bioquímica. Madrid: Interamericana-McGraw_Hill. Rodney, B. (1999). El ciclo del ácido cítrico. En B. Rodney, Conceptos de Bioquímica (págs. 489-494). México: International Thomson Editores S.A de C.V.

Universidad Nacional de Colombia (2003). Laboratorio de Bioquímica. Bogotá: Universidad Nacional.

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ANEXO ASPECTOS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO13 El trabajo en el laboratorio requiere la observación de una serie de normas de de seguridad que eviten posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se está haciendo.

3.1 NORMAS PERSONALES • •

• • • • •

•

• •

• • •

•

•

• •

Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material. Es conveniente la utilización de bata, ya que evita que posibles proyecciones de sustancias químicas lleguen a la piel. Por supuesto además, evitarás posibles deterioros en sus prendas de vestir. Use gafas de seguridad. Si tienes el pelo largo, es conveniente que lo lleve recogido. En el laboratorio está terminantemente prohibido fumar, ni tomar bebidas ni comidas. Antes de utilizar un compuesto, asegurarse bien de que es el que se necesita, fijarse bien el rótulo. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con el profesor. Verifica el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo. Cuando los instrumentos no estén siendo usados deben permanecer desenchufados. Usa siempre guantes de asbesto, para el aislamiento térmico, al manipular material caliente. Es muy importante que cuando los productos químicos de desecho se viertan en la pila de desagüe, aunque estén debidamente neutralizados, debe dejarse que circule por la misma, abundante agua. No tocar con las manos y menos con la boca, los productos químicos. No pipetear con la boca, se debe utilizar una pera manual o dispositivo que se disponga para tal fin. Los ácidos requieren un cuidado especial. Nunca se debe adicionar agua sobre ellos, cuando se quiera diluirlos; siempre al contrario, es decir, ácido sobre agua. Tenga en cuenta que normalmente hay desprendimiento de calor. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) no deben estar cerca de fuentes de calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se hará al baño María, nunca directamente a la llama. Si se vierte sobre ti cualquier ácido o producto corrosivo, lávate inmediatamente con mucha agua y avisa al profesor. Al preparar cualquier disolución se colocará en un frasco limpio y rotulado convenientemente. Cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio.

•

El vidrio antes decaliente tocarlo. no se diferencia a simple vista del vidrio frío. Para evitar quemaduras, dejarlo enfriar • Las manos se protegerán con guantes o trapos cuando se introduzca un tapón en un tubo de vidrio. • Si tienes que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, observa cuidadosamente estas dos normas: o Ten sumo cuidado y ten en cuenta que la boca del tubo de ensayo no apunte a ningún compañero. Puede hervir el líquido y salir disparado, por lo que podrías ocasionar un accidente. o Calienta por el lateral del tubo de ensayo, nunca por el fondo; agita suavemente. • Cuando se determinan masas de productos químicos con balanza, se colocará papel de filtro sobre los platos de la misma y si es necesario, porque el producto a pesar fuera corrosivo, se utilizará un vidrio de reloj. • Se debe evitar cualquier perturbación que conduzca a un error, como vibraciones debidas a golpes, aparatos en funcionamiento, soplar sobre los platos de la balanza, etc. 3.2 NORMAS PARA EL MANEJO DE REACTIVOS Y SOLUCIONES La alta calidad en un análisis químico requiere reactivos y soluciones de excelente pureza. Las siguientes normas deben observarse para prevenir la contaminación accidental de los reactivos y de las soluciones:

13 13


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ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA GUIA COMPONENTE PRÁCTICO DEL CURSO: 201103 – BIOQUÍMICA •

•

•

Seleccionar el reactivo químico de mejor calidad que se encuentre disponible. Elegir la botella de menor volumen para obtener la cantidad deseada. Tapar la botella inmediatamente después de haber tomado la cantidad deseada. Por ningún motivo delegue a otro esta acción. Mantener los tapones de las botellas de los reactivos entre los dedos, nunca debe colocarse un tapón sobre la mesa.

•

•

A queelse diga otra cosa, nunca se debe devolver el reactivo a una botella. El dinero ahorrado pormenos retornar exceso de reactivo rara vez supera el riesgo de contaminar toda la botella. A menos que se diga otra cosa, nunca se deben insertar espátulas, cucharas, o cuchillos en una botella que contenga un reactivo sólido.

• 3.3 MANEJO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS

La seguridad en el laboratorio no se limita únicamente a la protección personal o de la infraestructura, sino también a un manejo adecuado de los reactivos químicos encaminado a preservarlos de la contaminación y del desperdicio. •

Sustancias sólidas Como costumbre se debe leer la etiqueta de un reactivo antes de usarlo. Los reactivos sólidos normalmente se almacenan en recipientes de boca ancha y antes de abrirlos se gira e inclina la vasija de tal manera que algo del contenido pase a la tapa plástica. A continuación se remueve cuidadosamente la tapa con sólido dentro de ella y se golpea suavemente hasta obtener la cantidad deseada. Cuando se requieren cantidades apreciables comparadas con el contenido del frasco, se inclina la botella suavemente y se gira hacia atrás y hacia adelante hasta retirar lo necesario. Si el reactivo se encuentra compactado, se tapa el recipiente y se agita fuertemente para lograr romper los terrones. Evitar introducir elementos como destornilladores, espátulas de hierro u otro objeto que pueda contaminar el sólido. Si el reactivo es muy fino y libera polvo fácilmente, debe utilizarse una mascarilla apropiada.

•

Sustancias líquidas Los líquidos se almacenan por lo general en recipientes de boca angosta o en frascos con gotero. Para medir una cantidad de líquido, sea una solución o un líquido puro, se debe sacar una pequeña porción a un vaso limpio y seco, y de allí se toma la cantidad requerida mediante una pipeta. No deben introducirse pipetas o cualquier aotro dispositivo directamente de la botella que contiene el líquido, esto conduce generalmente la contaminación de todo el dentro contenido. Cuando se van a transferir líquidos desde un gotero tipo medicinal, la manera más correcta es verter el líquido sin introducir el gotero en el recipiente en el cual se va a almacenar el líquido, para evitar la posibilidad de contaminación del gotero y de la solución original.

3.4 CAMPANA DE EXTRACCIÓN Las reacciones que liberan gases tóxicos o corrosivos deben realizarse dentro de una vitrina o campana de extracción. Este dispositivo es una cabina provista de un ventilador que succiona el aire del laboratorio llevando los gases fuera de él.

3.5 SÍMBOLOS DE RIESGO Para manejar con seguridad las sustancias químicas se han ideado diversos códigos dependiendo de la casa fabricante, pero en general los sistemas clasifican las sustancias en las siguientes categorías:

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•

Sustancias explosivas Peligro. Este símbolo señaliza sustancias que pueden explotar bajo determinadas condiciones. Ejemplo: dicromato de amonio. Precaución. Evitar choques, percusión, fricción, formación de chispas y contacto con el calor.

•

Sustancias oxidantes (comburentes) Peligro: Los compuestos comburentes pueden inflamar sustancias combustibles o favorecer la amplitud de incendios ya declarados, dificultando Su extinción. Ejemplo: permanganato de potasio, peróxido de sodio. Precaución: Evitar cualquier contacto con sustancias combustibles.

•

•

Sustancias fácilmente inflamables Sustancias autoinflamables: Ejemplo: alquilos de aluminio, fósforo. Precaución. Evitar contacto con el aire. Gases fácilmente inflamables: Ejemplo: butano, propano. Precaución. Evitar la formación de mezclas inflamables gas-aire y aislar de fuentes de ignición. Sustancias sensibles a la humedad: Productos químicos que desarrollan emanaciones de gas inflamable al contacto con el agua. Ejemplo: litio, borohidruro de sodio. Precauciones: evitar contacto con agua o con humedad. Líquidos inflamables En términos muy sencillos, los líquidos inflamables son aquellos que fácilmente pueden arder. El que un líquido arda con más o menos facilidad depende de su punto de llama. Entre más bajo sea este punto más fácilmente arde el reactivo y por lo tanto mayor cuidado se ha de tener en su manejo, almacenamiento y transporte. Con estos líquidos se ha realizado una clasificación teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto y su solubilidad en el agua:

o

o

Peligro Clase A Esta clasificación se le asigna a líquidos que tienen un punto de llama por debajo de 100 ºC y que no se disuelven en el agua a 15 ºC. AI

Líquidos con punto de llama por debajo de 21 ºC.

AII

Líquidos con punto de llama entre 21 y 55 ºC.

AIII

Líquidos con punto de llama entre 55 y 100 ºC.

Peligro Clase B Esta clasificación se le asigna a líquidos que tienen punto de llama por debajo de 21 ºC y que se disuelven en agua a 15 ºC, o a aquellos cuyos componentes inflamables se disuelven en agua también a 15 ºC. Este tipo de líquidos no se puede apagar con agua.

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ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA GUIA COMPONENTE PRÁCTICO DEL CURSO: 201103 – BIOQUÍMICA •

Sustancias tóxicas Peligro: Tras una inhalación, ingestión o absorción a través de la piel pueden presentarse, en

general, trastornos orgánicos de carácter grave o incluso la muerte. Ejemplo: trióxido de arsénico, cloruro de mercurio (II). Precaución: Evitar cualquier contacto con el cuerpo y en caso de malestar acudir inmediatamente al médico. •

Sustancias nocivas Peligro: La incorporación de estas sustancias por el organismo produce efectos nocivos de poca trascendencia. Ejemplo: tricloroetileno. Precaución: Evitar el contacto con el cuerpo humano así

como la inhalación de vapores. En caso de malestar acudir al médico. •

Sustancias corrosivas Peligro: Por contacto con estas sustancias se destruye el tejido vivo y también otros materiales. Ejemplo: bromo, ácido sulfúrico. Precaución. No inhalar los vapores y evitar el contacto con la piel,

los ojos y la ropa. •

Sustancias irritantes Peligro: Este símbolo destaca en aquellas sustancias que pueden producir acción irritante sobre la

piel, los ojos sobre los órganos respiratorios. amoníaco, cloruro de bencilo. Precaución. No inhalar losyvapores y evitar el contacto con la Ejemplo: piel y los ojos.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS14 4.1 DISOLUCIÓN DE YODO Reactivos 1. Yodo, 1.0 g 2. Agua destilada, 300.0 mL Procedimiento Se mezclan ambos reactivos y se filtra la solución.

4.2 REACTIVO DE LUGOL – DETECCIÓN DE ALMIDÓN En la detección de almidón se emplea el reactivo Lugol. El almidón y el yodo forman un complejo de color violáceo. Si se le agrega unas gotas de lugol a una muestra y esta permanece de color amarillento, la reacción es negativa. Si da un color azul violáceo es positivo.

Reactivos 1. Yodo (I ), 1.0 g 2. Yoduro potásico (KI ), 2.0 g 3. Agua destilada, 300.0 mL Procedimiento Se mezclan los tres reactivos y se filtra la solución. La solución final que se obtiene presenta color ámbar.

4.3 REACTIVO DE TOLLENS – DETECCIÓN DE ALDEHÍDOS 14 14


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En las pruebas que se utiliza este reactivo se forma un precipitado de plata que se deposita en la superficie de los recipientes de vidrio, formando un espejo de plata, por lo que no se recomienda la agitación. Se debe utilizar recién preparado porque de lo contrario no se forma el espejo de plata. La reacción para la preparación del reactivo de tollens es la siguiente: AgNO3 + NH 4OH = Ag(NH 3 )2 OH

Se estabiliza por la adición de NaOH . Se utiliza para identificar aldehídos ya que ocurre la siguiente reacción: RCHO + 2 Ag(NH 3 )2 OH = RCOONH 4 + 2Ag + 3NH 3 + H 2 O

En donde la plata se precipita formando un espejo de plata o un precipitado gris.

Reactivos 1. NaOH al 5%, dos gotas 2. AgNO3 al 5%, 1.0 mL 3.

NH 4OH , 2N

Procedimiento Cuando se requiera el reactivo, se debe mezclar en un tubo de ensayo dos gotas de una disolución de NaOH al 5% y 1.0 mL de disolución acuosa de AgNO3 al 5%. Agitar el tubo y añadir gota a gota NH 4OH 2N, hasta que se consiga disolver el precipitado de AgOH , que previamente se había formado. Si es necesario se debe filtrar la solución. No se debe exceder en el uso del NH 4OH 2N para que el reactivo así preparado sea bastante sensible. Debe trasladarse a un frasco opaco ya que la solución puede ser alterada por la acción de la luz.

Precaución El isocianato de plata, AgNCO, compuesto muy explosivo en seco, puede estar presente en los residuos de las soluciones del reactivo de Tollens; por esta razón, es conveniente tirar el resto de la disolución de Tollens no utilizada y lavar los tubos con HNO3 diluido (disuelve el espejo de plata formado).

4.4 REACTIVO DE FEHLING – DETECCIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES El reactivo de Fehling, tambien conocido como Licor de Fehling, es una disolución descubierta por el químico alemán Hermann von Fehling y que se utiliza como reactivo para la determinación de azúcares reductores. Sirve también para demostrar la presencia de glucosa en la orina.

El ensayo conyelreduce licor de Fehling se funda el poder reductor del de grupo carbonilo un aldehído. Éste se oxida a ácido la sal de cobre (II) enenmedio alcalino a óxido cobre (I), quede forma un precipitado de color rojo. Un aspecto importante de esta reacción es que la forma aldehído puede detectarse fácilmente aunque exista en muy pequeña cantidad. Si un azúcar reduce el licor de Fehling a óxido de cobre (I) rojo, se dice que es un azúcar reductor. Se utiliza como reactivo para la determinación de azúcares reductores, y es útil para demostrar la presencia de glucosa en la orina, y también para detectar derivados de la glucosa como la sacarosa o la fructosa.

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Al mezclar las soluciones A y B de Fehling se forma complejo con el ión cúprico que es reducido por los aldehídos. Si la reacción es positiva se forma un precipitado rojo de CuO 2. Al reaccionar con monosacáridos, se torna verdoso; si lo hace con disacáridos, toma el color del ladrillo. La reacción que se produce es la siguiente: RCHO + 2Cu++ + OH-

→

RCOOH + CuO2 + H 2 O

Reactivos 1. Sulfato de cobre (CuSO4), 34.64 g 2. Tartrato sódico potásico (KNa(C 4H 4O6 ) · 4H 2 O), 17.6 g 3. Hidróxido sódico en escamas (NaOH ), 7.7 g Procedimiento Se preparan las soluciones A y B de la siguiente manera: • •

Solución A: Se disuelven 34.64 g de sulfato de cobre en 500 mL de agua. Solución B: Se disuelven 17.6 g de tartrato sódico potásico y 7.7 g de hidróxido sódico en 50 mL de agua.

Cuando se requiera su utilización se mezclan volúmenes iguales de cada una de las soluciones. Ambas soluciones se guardan separadas hasta el momento de su uso para evitar la precipitación del hidróxido de cobre (II).

4.5 REACTIVO DE BIURET – DETECCIÓN DE PROTEÍNAS Para la detección de proteínas en los alimentos se usa el reactivo de Biuret. cual se fundamenta en la formación de un complejo coordinado entre los iones cúpricos del reactivo y el enlace peptídico de la proteína, reacción que transcurre en medio alcalino. Si al agregar unas gotas del reactivo la muestra no cambia de color, la reacción es negativa; en este caso se puede decir que la muestra no contiene proteínas o presenta una cantidad que no es posible detectar. Si la muestra cambia de color, primero a un tono rosado, luego se pone azul y, finalmente, violeta, la reacción es positiva, lo que indica la presencia de proteína.

Reactivos 1. 2. 3.

Sulfato cúprico (CuSO4.5H2O), 2.5 g Hidróxido de sodio en escamas, 440g Agua destilada

Procedimiento Disuelva 2.5 g de sulfato cúprico en un litro de agua destilada. Disuelva 440 g de hidróxido de sodio en un litro de agua destilada. Luego mezcle estas dos soluciones. Esta preparación debe almacenarse en botellas oscuras (color ámbar).

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